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Proteomforschung: Einführung

Die Protein-Sequenzierung

Dank der rasanten Fortschritte der Genomforschung sind immer mehr DNA-Sequenzen bekannt. Daraus lässt sich zwar die entsprechende Aminosäure-Sequenz des codierten Proteins ableiten, aber es fehlen viele wichtige Informationen:

  • Wird das Protein posttranslational modifiziert?
  • Wie ist die zeitliche Abfolge der Protein-Expression? Wird das Protein nur in bestimmten Entwicklungsstadien oder unter bestimmten Umweltbedingungen synthetisiert?
  • Wie ist die räumliche Verteilung des Proteins in der Zelle, kommt es in allen Kompartimenten vor oder nur in einem bestimmten?
  • Geht das Protein Wechselwirkungen mit anderen Molekülen, regulatorische Faktoren und Reaktionskaskaden ein?

Alle diese Fragen lassen sich nur durch die Analyse des Proteoms (von engl. "protein complement expressed by the genome") klären. Hierzu werden hoch empfindliche Analyse- und Detektionssysteme benötigt, mit denen man komplexe Mischungen von Proteinen auftrennen und einzelne Polypeptide daraus nachweisen kann. Durch die Aufklärung der Proteinsequenz lassen sich verschiedene Rückschlüsse ziehen: Durch Homologiesuche in Datenbanken können dem Protein eventuell bestimmte Strukturmotive oder Funktionen zugeordnet werden. Ebenso kann das Protein dadurch mit den entsprechenden genomischen Daten in Verbindung gebracht werden.

Der Erste, der die komplette Aminosäure-Sequenz eines Proteins entschlüsselte, war der spätere Nobelpreisträger Frederick Sanger. Ihm gelang 1953 die Aufklärung der Struktur des Rinderinsulins, indem er das Protein sauer hydrolysierte, die so generierten Di-, Tri-, und Tetrapeptide über Papierchromatographie trennte und dann mit 2,4-Dinitrochlorbenzol (Sanger'sches Reagenz) N-terminal markierte. Nach der Hydrolyse der markierten Peptide konnte die gelbe N-terminale DNP-Aminosäure über zweidimensionale Papierchromatographie identifiziert werden.

Pehr Edman legte den Grundstein zur Konstruktion eines automatischen Sequenzers, indem er ein Verfahren zur sequentiellen Degradierung des Polypeptids vom N-Terminus aus entwickelte. Dabei wird im ersten Schritt, der Kopplung, die N-terminale Aminosäure mit Phenylisothiocyanat (PITC) umgesetzt. Das Kopplungsreagenz reagiert mit der freien, N-terminalen α-Amino-Gruppe unter Bildung eines Phenylthiocarbamoyl-Peptids (PTC-Peptid). Die nachfolgende Behandlung mit einer wasserfreien starken Säure, z. B. Trifluoresssigsäure, bewirkt eine Cyclisierung und Freisetzung der ersten Aminosäure als 2-Anilino-thiazolinon-Derivat (ATZ-Aminosäure). Die zurückbleibende, um einen Rest verkürzte Polypeptid-Kette kann weiteren Abbau-Cyclen unterworfen werden. Das ATZ-Derivat wird in einen Konverter überführt und durch Behandlung mit einer wässrigen Säure zum stabileren Phenylthiohydantoin (PTH-Aminosäure) isomerisiert, welches mit chromatographischen Methoden (bei Edman war es wieder die Papierchromatographie) analysiert und identifiziert werden kann.

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