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Proteomforschung: Einführung

Die zweite Dimension: SDS-PAGE

Im Anschluss an die isoelektrische Fokussierung (IEF) wird der Gelstreifen, auf dem die IEF durchgeführt wurde auf ein SDS-Flachgel transferiert. Für die Elektrophorese von Proteinen verwendet man im allgemeinen Gele aus dem vernetzten Polymer Polyacrylamid. Dieses Polymer wirkt wie ein Sieb: es verlangsamt Proteine, die in einem elektrischen Feld wandern in etwa proportional zu ihrer molekularen Masse. Soll ein Protein nur nach seiner Größe und nicht nach seiner Ladung aufgetrennt werden, wird das Detergens Natrium-dodecyl-sulfat (engl. "sodium dodecyl sulfate", SDS) zugesetzt. SDS maskiert die Eigenladungen der Proteine und verursacht so eine hohe negative Nettoladung des Proteins. Zudem verändert dieses Detergens die native Konformation des Proteins, so dass alle Proteine eine mehr oder weniger ähnliche Konformation im Gel aufweisen. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (engl. "SDS polyacrylamide gel electrophoresis", SDS-PAGE) trennt Proteine also nur nach molarer Masse auf.

Abb.1

Um möglichst viele Proben gleichzeitig untersuchen zu können (High-Throughput-Analyse), benutzt man Elektrophorese-Kammern, in denen bis zu zehn Gele gleichzeitig laufen können. Die Proteinspots werden durch eine hoch empfindliche Silberfärbung sichtbar gemacht. Interessante Spots können dann ausgeschnitten und weiter analysiert werden. Um den Durchsatz und die Bearbeitungsgeschwindigkeit von Proteomanalysen zu erhöhen werden dieser und die weiteren Arbeitsschritte meist von speziellen Robotern durchgeführt.

Abb.2

Die Abbildung zeigt ein nach der Elektrophorese mit Silbernitrat gefärbtes Gel in einem Picking-Roboter, der nach einem einprogrammierten Schema Spots aus dem Gel ausstanzt und in geeignete Probengefäße für die weitere Verarbeitung (tryptische Verdauung, Massenspektrometrie) überführt.

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