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Proteomforschung: Einführung

Sequenzierung mithilfe von Massenspektrometrie

Im Gegensatz zu den Nucleinsäuren, die aus nur vier verschiedenen Bausteinen bestehen, sind Proteine aus 20 unterschiedlichen Aminosäuren aufgebaut, die darüber hinaus auch noch chemisch modifiziert sein können. Eine Bestimmung der Aminosäure-Sequenz von Proteinen und Peptiden gestaltet sich deshalb wesentlich schwieriger als eine Analyse der entsprechenden Gene, liefert aber noch mehr Informationen, die für das Leben einer Zelle von entscheidender Bedeutung sind. In den letzten Jahren haben sich leistungsfähige massenspektrometrische Verfahren zur Protein-Sequenzierung als Alternative zum klassischen Edman-Abbau immer stärker durchgesetzt. Zur Analyse von Proteinen eignen sich Massenspektrometer in denen die Elektrospray-Ionisierung (ESI) angewandt wird oder MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation) -Geräte. Charakteristisch für beide Verfahren ist die schonende Desorption, welche die Fragmentierungsprozesse nicht beeinflusst, so dass auch höhermolekulare Polypeptide nachweisbar sind. Während MALDI-Geräte einfach geladene Ionen erzeugen, entstehen bei der Elektro-Spray-Ionisierung (ESI) mehrfach geladene Ionen, ohne dass es bereits zu einer Fragmentierung kommt. Dadurch ergeben sich relativ kleine Werte für m/z. Das Verteilungsmuster dieser Werte erlaubt eine eindeutige Besteimmung der Masse des Moleküls.

Hinweis
Massenspektrometrische Vefahren sind sehr empfindlich und zeichnen sich durch einen hohen Probendurchsatz in relativ kurzer Zeit aus. Besondere Bedeutung hat die MS auch bei der Lokalisation und Charakterisierung posttranslationaler Modifikationen, wie Glycosylierung, Phosphorylierung, Methylierung, Deamidierungen, Oxidation oder Bildung von Disulfid-Brücken.
Abb.1

Die Probe wird gemeinsam mit einer organischen Matrix kristallisiert, deren Moleküle die Wellenlänge des Lasers absorbieren. Durch einen Laserpuls werden die Matrix und die eingebetteten Biomoleküle ionisiert und in die Gasphase überführt. Die Ionen werden anschließend in einem elektrischen Feld beschleunigt. Die Flugzeit der ionisierten Moleküle bis zum Detektor ist proportional zu ihrer Masse und ihrer Ladung und gibt damit Aufschluss über das Molekulargewicht der Probe.

Abb.2

Die Auftragung der Signalintensität (a.i.) gegen den Quotienten aus Masse und Ladungszahl (m/z) ergibt direkt das Molekulargewicht eines Fragments und identifiziert damit nicht nur die Aminosäure, sondern liefert darüber hinaus weitere wertvolle Informationen, z.B. über posttranslationale Modifikationen.

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