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Proteomforschung: Einführung

Die erste Dimension (isoelektrische Fokussierung, IEF)

Abb.1
IEF-Apparatur

Die erste Dimension der 2D-Gelelektrophorese: Die isoelektrische Fokussierung, die hier in einer Kammer für acht Proben durchgeführt wird.

Die erste Dimension der zweidimensionalen Gelelektrophorese ist eine isoelektrische Fokussierung.

Da Proteine aus Aminosäuren aufgebaut sind, die unterschiedliche geladene Seitenketten besitzen, trägt jedes Protein - je nach pH-Wert - eine ganz charakteristische Eigenladung.

Bringt man geladene Proteine in ein elektrisches Feld, so wandern sie entsprechend ihrer Ladung unterschiedlich weit. Als Puffer werden bei dieser Gelelektrophorese so genannte Ampholyte verwendet, die ebenfalls viele Ladungen tragen und sich dementsprechend im elektrischen Feld anordnen. Sie bauen so einen pH-Gradienten auf, an dem entlang sich die Proteine bewegen, bis sie den pH-Wert erreicht haben, der ihrem isoelektrischen Punkt (pI) entspricht. An diesem Punkt werden positive und negative Ladungen ausgeglichen, sodass die Nettoladung der Proteine praktisch null beträgt und sich das Protein im elektrischen Feld nicht mehr bewegt

Die Ampholyte haben eine geringere molekulare Masse und bilden den gewünschten pH-Gradienten aus, bevor die Proteine ihren pI erreichen. Der Vorteil der Methode liegt darin, dass einerseits kaum Diffusion der Proteine stattfindet (sie werden durch das elektrische Feld an ihrem pI gehalten), und andererseits wenig Hitze entsteht, da der Stromfluss im Prinzip zum Erliegen kommt, wenn alle Proteine ihren isoelektrischen Punkt erreicht haben.

Die IEF wird auf schmalen Gelstreifen ausgeführt und liefert eine lineare Verteilung der Proteine. Diese Gelstreifen werden dann für die zweite Dimension der Gelelektrophorese auf ein SDS-Polyacrylamidgel (SDS-PAG) gebracht.

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