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Strukturanalyse und Proteinkristallographie

Anwendung der Neutronenbeugung

Da sich die Röntgen- und Neutronenbeugung in vielen Fällen wunderbar ergänzen bilden sie gemeinsam die leistungsfähigste direkte Methode zur Aufklärung der 3D-Struktur kristallisierbarer Proteine. Während die Röntgenbeugung die hochauflösende Analyse elektronendichter Molekülbereiche ermöglicht, versagt sie bei der geringen Elektronendichte von Wasserstoff völlig. Im Gegensatz hierzu liefert die Neutronenbeugung in Geräten mit einer mittleren - hohen Auflösung (1 - 3 Å) Aufschluß über die von anderen Methoden übersehene Position der Wasserstoffatome bzw. Protonen sowie der Integration von Wassermolekülen in die Kristallstruktur. Bei geringerer Auflösung (10 - 20 Å) liefert sie wertvolle Informationen über die Struktur amphi- oder lipophiler Molekülanteile bzw. über die Gestalt der Lösungsmittelhülle eines Proteins. Dies ist besonders wichtig, da die meisten Proteine zwischen 40 und 60 (v/v) % Lösungsmittel enthalten. Dadurch können Proteine selbst im Kristallverbund eine Konformation beibehalten, die der einer konzentrierten Lösung entspricht. Durch die hohe Mobilität der Wasser-Moleküle erreichen jedoch erst Moleküldynamik-Simulationen von kristallographischen Modellen ein realistisches Bild des intakten Proteins. Ein weiteres Einsatzgebiet der Neutronendiffraktion von Proteinen ist die Aufklärung der Anordnung von Seitengruppen-Amiden, die von der Röntgenstrukturanalyse nicht abgedeckt wurden.

Tab.1
Neutronenbeugungslängen biologisch relevanter Atomkerne; Abk. erkl.: 1 fm = 1 x 10-15m
ElementAtomzahl Zkohärente Neutronenbeugungslänge b c [ f m ] *
H1-3.74
D16.67
C66.65
N79.36
O85.80
P155.13
S162.85

* Mit Ausnahme von H und D beziehen sich die Angaben auf das natürliche Isotopengemisch. Daten aus: Sears, V. F. (1992) Neutron scattering lengths and cross sections, Neutron News 3, 26-37

Wie in der Tabelle ersichtlich, werden Neutronen vom Kern des Wasserstoff-Atoms etwa 10-fach stärker gebeugt als von jedem anderen Atomkern. Besonders interessant ist der große Unterschied zwischen Wasserstoff und Deuterium. Dadurch bietet die Neutronenbeugung nicht nur einen hochspezifischen Nachweis von Wasserstoff-Atomen, sondern sie erlaubt es bestimmte Teile eines Moleküls durch den Ersatz von Wasserstoff mit Deuterium zu maskieren und damit aus einer Kristallographie auszublenden.

Abb.1
Aus: Shu, F., Ramakrishnan, V. et al (2000) Enhanced visibility of hydrogen atoms by neutron crystallography on fully deuterated myoglobin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3872-3877 . Mit freundlicher Genehmigung: Copyright (2000) National Academy of Sciences, U.S.A.

Direkte Positionsbestimmung von Deuterium- (D) bzw. Wasserstoff-Atomen (H) über positive Peaks in den auf einer Fourier-Analyse der Diffraktionsmuster basierenden 3D-Karten am Beispiel der Phenyl-Gruppe der Aminosäure 43 (Phe-43) des Myoglobins (Mb). A. Röntgenkristallstruktur von vollständig deuteriertem Mb. Auflösung 6.0 - 1.5 Å Auflösung, Konturlinien: + 1.0 σ ( 0.84 e Å 3 ) . B. Neutronenbeugungskarte von nicht markiertem Mb. Auflösung 2.0 Å, violette Konturlinien: +1.0 σ, blau: -1.0 σ. C. Neutronenbeugungskarte von äquivalenten experimentellen Reflexionen im Bereich von 6.0 - 2.0 Å unter Austausch aller D durch H. Konturlinien violett: +1.0 σ, blau: -2.0 σ. D. Neutronenbeugungskarte von vollständig deuteriertem Mb in 6.0 - 2.0 Å Auflösung, Konturlinien: +1.0 σ (1.03 f m Å 3 ).

Abb.2
Aus: Shu, F., Ramakrishnan, V. et al (2000) Enhanced visibility of hydrogen atoms by neutron crystallography on fully deuterated myoglobin, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3872-3877 . Mit freundlicher Genehmigung: Copyright (2000) National Academy of Sciences, U.S.A.

Bestimmung der Orientierung von Wasser-Molekülen über Neutronendichtekarten. Die weiße Karte basiert auf einer Fourier-Analyse des Neutronendiffraktionsmusters von vollständig deuteriertem Myoglobin (Mb) (pdb-Code: 1CQ2 ) in einer Auflösung von 6.0 - 2.0 Å. In rot: Elektronendichtekarte einer Röntgenstrukturanalyse in 1.5 Å Auflösung eines ebenfalls vollständig deuteriertem Mb-Kristalls.

Die klassische Einzelkristall-Diffraktion mit einer festgelegten Wellenlänge (engl. "single crystal diffraction at a fixed wavelength") wird zunehmend durch Einzelkristall-Methoden unterstützt, wobei man nach dem Laue-Verfahren vorgeht. Da man bei der Laue-Technik Neutronen unterschiedlicher Wellenlänge verwendet, erhöht sich der auf den Kristall einwirkende Strahlungsfluss. Dies führt zu einem wesentlich höheren Informationsgehalt der Beugungsbilder, aber auch zu Messungenauigkeiten durch den verstärkten Rauschabstand der Beugung. Der Einsatz neuartiger Photoplatten und Korrekturverfahren kann man jedoch diesen Nachteil kompensieren. Mit Hilfe dieser Methode kann die gesamte Hydrationshülle von Proteinen aufgeklärt werden.

Hinweis
Eine hervorragende Internetseite zur Neutronenbeugung in der Biologie findet man bei Dr. Gilbert (Division of Structural Biology, University of Oxford). Einige Abbildungen von der genannten "Website" sind mit Erlaubnis des Autors in leicht abgeänderter Form in dieser Lerneinheit verwendet worden.
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