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Strukturanalyse und Proteinkristallographie

NMR-Spektroskopie

Die so genannte kernmagnetische Resonanz (engl.nuclear magnetic resonance, NMR) entsteht, wenn Atomkerne, die einen Spin (Eigendrehimpuls) aufweisen (z.B. H1, C13, N15, P31), einem statischen Magnetfeld ausgesetzt und gleichzeitig mit einem zweiten, oszillierenden Magnetfeld konfrontiert werden. Bei einem bestimmten Wert dieses zweiten oszillierenden Magnetfeldes treten die Kerne in Resonanz und wechseln die Ausrichtung ihres Spins. Dies wird in der NMR-Spektroskopie in Form der Resonanzabsorption gemessen.

Abb.1
Prinzip der NMR-Spektroskopie

A. Ohne Einwirkung eines äußeren Magnetfeldes ist die Lage des Spins ungeordnet. B. Unter Einwirkung eines starken Magnetfeldes ordnen sich die Atomkerne derart an, dass ihre Rotationsachsen entweder in oder entgegen der Feldrichtung verlaufen. C. Legt man ein zweites oszillierendes Magnetfeld an und stimmt die Frequenz der Oszillation auf die Rotationsfrequenz des Kernspins ab, wechseln die Kerne die jeweilige Ausrichtung zum ersten statischen Magnetfeld. Diese Umkehr des Spins verursacht die so genannte Resonanzabsorption, die in NMR-Spektrometern gemessen werden kann. Vorlage von Dr. Hans Briem (ehem. Uni Bremen).

Da die Resonanzabsorption vom Atomtyp und der chemischen Umgebung einer Probe abhängig ist (chemische Verschiebung: relative Lage der Resonanzabsorption bezogen auf eine Standardreferenz), liefert sie Informationen über die Struktur einer Substanz. Zur Analyse der komplexen Struktur von Proteinen bedient man sich mehrdimensionaler NMR-Messungen, in denen mehrdimensionale Spektren als Kreuzsignale analysiert werden. Damit ist es im Prinzip möglich, Proteine bis zu etwa 300 Aminosäuren auf ihre:

  1. Atomzusammensetzung sowie
  2. über kovalente Bindungen verknüpfte Nachbaratome und
  3. deren geometrische Anordnung zueinander zu untersuchen. Daraus resultiert auch
  4. die Abschätzung nicht-kovalenter Bindungen zwischen eng benachbarten Atomen.

Die Abschätzung der Distanz nicht-kovalenter Bindungen gelingt vor allem über den Kern-Overhauser-Effekt (engl.Nuclear Overhauser effect, NOE), über den der Transfer der Absorptionsresonanz über nicht-kovalent verbundene Atompaare gemessen werden kann. Über eine Liste aller kovalenten Bindungen innerhalb des Moleküls (Konnektivität) sowie die Abstandswerte zwischen den Atomen können die Raumkoordinaten der Atome in den so genannten Distanzgeometrie-Rechnungen festgelegt werden.

Abb.2

Cartoon einer Polypeptidkette bei unterschiedlicher Faltung im Raum

Abb.3

In mehrdimensionalen NMR-Spektren kann der Abstand zwischen nicht-kovalent gebundenen Atomen durch die so genannten Kreuzsignale (engl.cross-peaks) berechnet werden. Durch Sequenzieren kennt man die Position eines Atoms (z.B. A und B) in einer Polypeptidkette - nicht jedoch den Abstand zwischen zwei Atomen, da dieser durch die Sekundär-, Tertiär-und Quartärstruktur eines Proteins stark variieren kann. Die Intensität des Kreuzsignals ist ein Maß für die Nachbarschaft zwischen zwei Atomen.

Die Struktur komplexer Moleküle kann oftmals nicht eindeutig über die NMR-Spektroskopie bestimmt werden, da mehrere Strukturmodelle die experimentellen Befunde erklären können. Hier müssen parallel Simulationen der Torsionswinkel und anderer Parameter der Moleküldynamik durchgeführt werden. Verknüpft man die Befunde der NMR-Spektroskopie sowie der Moleküldynamik-Simulationen, erfüllt meist nur ein Modell alle experimentellen Befunde - damit kann die identifizierte 3D-Struktur als gesichert gelten.

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