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Strukturanalyse und Proteinkristallographie

Methoden zur 3D-Strukturanalyse von Proteinen

Die wichtigste Methode zur Bestimmung von 3D-Strukturen von Proteinen und anderen biologischen Makromolekülen mit atomarer Auflösung (Auflösung: ≤ 2,5 Å) ist die Proteinkristallographie, aber nicht von jedem Protein lassen sich 3d-Kristalle von genügender Größe, Stabilität und Qualität züchten. Die Proteinkristallographie bedient sich vor allem an den Phänomenen der Beugung bzw. Streuung von Röntgenstrahlen (Röntgenstrukturanalyse) oder Neutronen (Neutronenbeugung). Die NMR-Spektroskopie liefert ebenfalls atomare 3D-Strukturen, allerdings ist diese Methode bisher nur bis zu Molmassen von ca. 30 kDa angewendet worden. Lassen sich 2D-Kristalle, z. B. in Gegenwart nativer Lipide, gewinnen, so kann mit Hilfe der Elektronenkristallographie ein Strukturmodell erstellt werden. Mit Hilfe der Kryoelektronenmikroskopie in Verbindung mit bildverarbeitenden Techniken ist es mittlerweile gelungen, Auflösungen von ~ 3 Å in der Membranebene und ~ 5 Å senkrecht zur Membranebene zu erzielen (mittlere Auflösung, engl.medium resolution). Vor allem transmembranale Proteine, wie Bacteriorhodopsin, der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor oder der große Lichtsammler-Komplex des Photosystems II (engl.light harvesting complex II, LHC II) sind mit dieser Kombination von Techniken untersucht worden. Für den LHC II gibt es mittlerweile verbesserte 3d-Strukturen duch röntgenkristallographische Untersuchungen (s. pdb Codes: 2BHW und 1RWT) Detaillierte Strukturinformationen mittels elektronenmikroskopischer Methoden konnten auch von oligomeren wasserlöslichen Protein-enthaltenden Partikeln, wie Ribosomen oder Viren, oder dem αβ-Tubulin erhalten werden.

Tab.1
Vergleich zwischen der Röntgenstrukturanalyse und der Neutronenbeugung - Erklärung von Abkürzungen: MIR = Methode des multiplen isomorphen Ersatzes , (engl.multiple isomorphous replacement) ; MAD = anomale Röntgenstreuung (engl. multiple wavelength anomalous diffraction)
KriteriumBeugung von RöntgenstrahlungNeutronenbeugung
Woran wird gebeugt?Elektronen der AtomeAtomkern
Beugungsamplitude [m] ~ 10 11 10 12 ~ 10 12
KristalleigenschaftenMindestgröße von Kristallen für Messungen - abhängig von der Strahlenquelle (Strahlintensität - und qualität, Fluss) und der Goniometer-Geometrie; bei Synchrotronstrahlung ≦ 50 µm;jedoch bisweilen Kristallschäden durch Bestrahlung, Vermeidung durch Kühlung (fl. Stickstoff, fl. Helium) und / oder chemische Zusätze, wie Ascorbat oder Glutathion (Radikalfänger). größer: 1 m m 3 keine Strahlenschäden
Forschungsinstrumentezahlreich (in Europa vorhandene Synchrotrons: 1. ESRF in Grenoble; 2. Elettra, Triest, Italien; 3.Paul Scherrer-Institut, Villingen; Schweiz; sowie in Deutschland 4. DESY, Hamburg und 5. BESSY, Berlin historisch: Synchrotron Radiation Source (SRS) Daresbury, UKselten
PhasenproblemLösung möglich (z. B. MIR oder MAD) keine Lösung
DetektionsproblemeWasserstoff-Atome, keine Unterscheidung zwischen Isotopen. Atome der gleichen Periode können schlecht aufgelöst werden.?
VorteileViele Instrumente vorhanden, Durchführung mit kleineren Kristallen, Lösungsmöglichkeiten für das PhasenproblemLokalisierung von Wasserstoff-Atomen in Proteinen und in Lösungsmitteln. Dadurch Identifikation von Wasserstoff-Brücken, Konformationen von Methyl-Gruppen und Protonierungen.Orientierung seitenständiger Amid-Gruppen. Identifizierung von H2O-Molekülen im Protein, z. B. bei Bindungstaschen oder Kanal- bzw. Porenartigen Strukturen

Der Strahlengang (engl. beamline) ID13 am ESRF (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, Frankreich, s. eine Übersicht sämtlicher "Beamlines") bietet zur Messung von Einzelkristall-Diffraktionen ein Mikrogoniometer an, mit dem sensitive, kleine Protein-Kristalle entweder mit kühlbaren Schlaufen (engl.cryo-loops) oder in Kapillaren gemessen werden können. Bei der Methode des isomorphen Ersatzes wird mit Schweratomionen, wie Pt2+, Pb2+,Hg2+ bzw. J- oder Br-, gearbeitet. Die Schweratomionen diffundieren in die Proteinstruktur hinein und besetzen dort definierte Positionen. Aus den gemessenen Intensitätsdifferenzen an isomorphen nativen und derivatisierten Kristallen lässt sich die Lage der Schweratomionen bestimmen. Da sich isomorphe Kristalle weder in der Raumgruppe noch in den Zellkonstanten unterscheiden, kann man mit Hilfe dieser Experimente Informationen über die Phasen erhalten.

Literatur

Byron, O.; Gilbert, R. J. (2000): Neutron scattering: good news for biotechnology . In: Curr. Opin. Biotechnol.. 11 , 72-80
(1999): Crystallization of nucleic acids and proteins: a practical approach. A. Ducruix R. Gige (Hrsg.). 2ndNew York, Oxford University Press, ISBN: 978-0-19-963678-5
Henderson, R.; Baldwin, J. M.; Ceska, T. M.; Zemlin, F.; Beckmann, E.; Downing, K. H. (1990): Model for the structure of bacteriorhodopsin based on high-resolution electron cryo-microscopy. In: J. Mol. Biol.. 213 , 899-929
Kühlbrandt, W.; Wang, D. N.; Fujiyoshi, Y. (1994): Atomic model of plant light-harvesting complex. In: Nature. 367 , 614-621
Kühlbrandt, W.; Williams, K. A. (1999): Analysis of macromolecular structure and dynamics by electron cryo-microscopy. In: Curr. Opin. Chem. Biol... 3 , 537-543

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