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Massenspektrometrie in der Proteindynamik

Isotopensubstitution: H/D-Austausch

H/D-Austausch
Der Austausch von Wasserstoff- durch Deuterium-Atome in einer Probe wird oft auch als H/D- oder H-D-Austausch (engl. hydrogen exchange oder HX) bezeichnet. Er ist ein Spezialfall der Isotopensubstitution.

Die Methode wurde 1954 von Kaj Linderstrøm-Lang in die Proteinbiochemie eingeführt, um Konformationsänderungen zu untersuchen.

Das Prinzip der Methode

In Lösung können einige der Wasserstoff-Atome eines Proteins ihre Position mit Wasserstoff-Atomen des Lösungsmittels tauschen. Wenn man ein Lösungsmittel wie z.B. schweres Wasser (Deuterium-Oxid, D2O) einsetzt, in dem der Wasserstoff durch ein schwereres Isotop (Deuterium, D) ersetzt wurde, wird das schwerere Isotop anstelle von Wasserstoff in das Protein eingebaut. Dadurch wird die Masse des Proteins größer und kann mittels spektroskopischer/spektrometrischer Methoden untersucht werden. Da der H/D-Austausch mit einer spezifischen Rate abläuft, die weitgehend von der Struktur des Proteins abhängig ist, gibt diese Methode wichtige Aufschlüsse über das dynamische Verhalten von Proteinen.

Abb.1
H/D-Austausch in Proteinen

In Proteinen können 3 verschiedene Gruppen von Wasserstoff-Atomen durch Ihr Verhalten in H/D-Austausch-Experimenten unterschieden werden:1.) kovalent an Kohlenstoff gebundener Wasserstoff (rot auf grünem Hintergrund) lässt sich nahezu überhaupt nicht von Deuterium verdrängen.2.) terminal in den Seitengruppen gebundener Wasserstoff (magenta auf hellblauem Hintergrund) wird dagegen sehr schnell ausgetauscht und kann deshalb in der Regel kinetisch nicht verfolgt werden.3.) Die an die Amid-Gruppen der Peptidbindungen gebundenen Wasserstoff-Atome (blau auf orange) stehen zwischen diesen Extremata und erlauben eine exakte Bestimmung der Kinetik des H/D-Austausches. Da die Wasserstoffe der Rückgrat-Amide durch die Ausbildung von Wasserstoff-Brücken auch für die Sekundärstruktur der Proteine bedeutsam sind, spielt die Methode auch in Faltungsstudien und der Untersuchung der Proteindynamik eine große Rolle.

Der Austausch von Wasserstoff gegen Deuterium wird entweder über Verdünnungsreihen, Dialyse und Gel-Filtrationschromatographie erreicht, wobei diese Markierung entweder kontinuierlich oder gepulst vorgenommen werden kann. Eine andere Methode ist die des Lösungsmittelaustausches nach Lyophilisierung (Gefriertrocknung) der Probe.

H/D-Austausch in der Neutronenbeugung

Die Anwendung des H/D-Austauschs in der Neutronenbeugung entstand als Nebeneffekt der Notwendigkeit die Proteinkristalle für mehrere Monate bis zu einem Jahr in D2O "einzuweichen". In der Proteinkristallographie dient der H/D-Austausch quasi als "Kontrastmittel". In klassischen Studien wie der Untersuchung des Trypsins (Kossiakoff & Spencer 1981) zeigte sich der Einfluss der Sekundärstruktur auf den H/D-Austausch. Die nichtsubstituierten Bereiche fanden sich gehäuft in den β-Faltblättern der Sekundärstruktur, wo sie gegen den Austausch abgeschirmt waren. In ähnlicher Weise erwiesen sich z.B. beim Lysozym α-Helices resistent gegen die Isotopensubstitution (Mason, McIntyre & Bentley 1984). Im Gegensatz hierzu zeigten sich teilweise oder vollständig substituierte Bereiche vor allem in Schleifenbereichen (engl.turn-regions; z.B. Crambin: Teeter & Kossiakoff 1984).

H/D-Austausch in der Spektroskopie

Während der H/D-Austausch traditionell vor allem in der NMR-Spektroskopie eingesetzt wurde, gewinnt seit den frühen 1990iger Jahren die Massenspektroskopie immer mehr an Bedeutung.

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Abb.2

Zeitskala einiger Schlüsselereignisse in der Proteindynamik: Die Stellung der H/D-Austausch-Methode in der Detektion dieser Ereignisse. Rollover: Bewegen Sie die Maus über die farbigen Flächen und Striche! Abkürzungen: HX: H/D-Austausch; MS: Massenspektrometrie.

Massenspektrometrische Analysen mittels ESI- oder MALDI-MS von mit Deuterium markierten Proteinen (HX-MS) sind unter anderem für die Beantwortung folgender Fragestellungen durchgeführt worden:

  • Verlauf der natürlichen Entfaltung bzw. Denaturierung von Proteinen
  • Registrierung von Faltungs- und Entfaltungs-Raten
  • Verlauf der Proteinfaltung: Zeitskala von einigen Millisekunden bis mehreren Tagen
  • Verlauf von Bindungen, Messungen der Bindungskonstanten und der interagierenden Oberflächen von Proteinen
  • DNA-Protein-Wechselwirkungen
  • Analyse von Elektronentransfer-Prozessen, wie z.B. die der Atmungskette oder des photosynthetischen Elektronentransportes, die mit Protonen-Freisetzungen und -aufnahmen gekoppelt sind

Dabei bietet die HX-MS mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden:

  • Es werden relativ geringe Mengen an Protein benötigt (ca. 500 pmol).
  • Selbst die größten oligomeren supramolekularen Proteinkomplexe, wie P22-Viren-Capside mit 19,6 MDa und Ribosomen aus E. coli mit 54 Proteinkomponenten und 3 großen RNA-Molekülen mit einer Gesamtmasse von 2,5 MDa, können untersucht werden.
  • Auch für andere Methoden schwer zugängliche Membranproteine können untersucht werden.

Weiterführende Links:

Eine sehr informative Webseite zu den HX-MS-Methoden findet man unter: HXMS.COM: A site devoted to the study of proteins with Hydrogen Exchange and Mass Spectrometry.

Literatur

Benjamin, D. R.; Robinson, C. V.; Hendrick, J. P.; Hartl, F. U.; Dobson, C. M. (1998): Mass spectrometry of ribosomes and ribosomal subunits. In: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 95 , 7391-7395
Kossiakoff, A. A.; Spencer, S. A. (1981): Direct determination of the protonation states of aspartic acid-102 and histidine-57 in the tetrahedral intermediate of the serine proteases: neutron structure of trypsin. In: Biochemistry. 20 , 6462-6474
Linderstrøm-Lang, K. (1958): Deuterium exchange and protein structure . In: in: Symposium on protein structure. A. Neuberger (Hrsg.). Methuen ,
Mason, S. A.; Bentley, G. A.; McIntyre, G. J. (1984): Deuterium exchange in lysozyme at 1.4 Å resolution . In: Basic Life Sci.. 27 , 323-334
Teeter, M. M.; Kossiakoff, A. A. (1984): The D2O structure of crambin by neutron-diffraction at 1.5 Å, . In: Acta Crystallogr.. 40 , C7
Tuma, R.; Coward, L. U.; Kirk , M. C.; Barnes , S.; Prevelige, P. E. (2001): Hydrogen-deuterium exchange as a probe of folding and assembly in viral capsids . In: J. Mol. Biol.. 306 , 389-396

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