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Massenspektrometrie in der Proteindynamik

Massenspektrometrie

Massenspektrometrie
Die Massenspektrometrie (MS) erzeugt aus einer Probe Ionen, trennt sie entsprechend ihrem Masse/Ladung Verhältnis (m/z) auf und registriert die getrennten Chargen, womit letztlich deren Molekülgewicht in einer Genauigkeit von 0,01% des Molekulargewichts der Gesamtprobe bestimmt werden kann.

Werden die Ionen von einer Photoplatte detektiert, so spricht man von von einer Massenspektroskopie. Dem gegenüber steht die Massenspektrometrie, bei der die getrennten Ionen elektrisch als Ionenstrom registriert werden. Die jeweils verwendeten Geräte bezeichnet man entsprechend als Massenspektrograph bzw. Massenspektrometer. Ein Massenspektrometer besteht prinzipiell aus folgenden Teilen (Abb. 1) :

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Abb.1

1. Probeneinlasssystem: Hier wird der Analyt durch eine Schleuse in das Hochleistungsvakuum des Massenspektrometers eingeführt (Gaschromatograph, Flüssigchromatograph oder Probenteller). 2. Ionenquelle: Die Probe wird z.B. durch Elektronenstoß (a), Elektrospray (b) oder matrix-unterstützte Laserpuls-Desorption (c) ionisiert. 3. Massenanalysator: Die freien gasförmigen Ionen werden durch eine Kombination aus Magnetfeld und elektrischem Feld (a), durch ein Quadrupol-Stabsystem (b), durch Einfang in einer elektrischen (c) oder magnetischen Ionenfalle (d) oder nach Flugzeit (e) analysiert. 4. Detektor: Registrierung der verschiedenen Ionen mittels Sekundärelektronenvervielfacher oder Channeltron. 5. Workstation (Datenstation).

Anhang: Zusatzinformationen - Die Ionenquelle und der Massenanalysator stehen unter Hochvakuum, um zu gewährleisten, dass die Ionen nach ihrer Erzeugung keine weiteren Stöße erfahren. Ad 2., Abk.: ESI: Elektrospray-Ionisation; EI: Elektronenstoß von engl. "electron impact"; MALDI: Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation von engl. "Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation". Ad. 3: TOF: Flugzeit von engl. "time of flight"; FT-ICR: Fourier-transformierte Ionen-Cyclotron-Resonanz.

Spezielle Verfahren geben nicht nur Auskunft über die Massen von Ionen, sondern auch über bestimmte strukturelle Eigenschaften des Analyten. In der so genannten Tandem-MS, wird dies durch eine vorherige gezielte Fragmentierung der Probe und die darauf folgende Untersuchung der Teilmassen erreicht. Hierbei werden zwei Massenspektrometer-Analysatoren in Serie geschaltet und typischerweise mit einer Gas-Stoß-Zelle gekoppelt. Diese Vorgehensweise ist besonders für die Sequenzierung von Peptiden und Oligonucleotiden geeignet, findet aber auch für den spezifischen Nachweis von Wirkstoffmetaboliten Anwendung.

MALDI-TOF-Massenspektrometrie

Bei der MALDI-TOF-Massenspektrometrie wird zunächst der Analyt nach spezieller Vorbereitung mit Matrixmolekülen - vide infra - gemischt und in eine Probenteller-Kavität mittels einer speziellen Mikropipette eingebracht. Das Volumen beträgt dabei 0,5-1,5 µl. Die Konzentrationen von Analyt und Matrix-Material betragen hier zwischen 100 nM und 10 µM bzw. 0.1M, d.h. die Konzentration der Matrix-Moleküle ist 104-106 höher als die des Analyten. Die Probe wird anschließend an der Luft oder mit Hilfe eines Stickstoffstromes getrocknet. Voraussetzung für eine erfolgreiche Laserblitz-induzierte Desorption - und demzufolge für eine Analyse - ist eine Kokristallisation von Matrixmolekülen und Probe. Bisweilen wird die Probe nach dem Trocknen noch einmal mit dem Lösungsmittel des Analyten nachgewaschen und mit einem gleichen Volumen Matrixlösung überschichtet. Nach erneuter Trocknung wird der Probenteller nun in den Probenraum eingeführt. Sobald ein genügend gutes Vakuum errreicht ist, wird die Kokristallisation mit Hilfe einer Videokamera kontrolliert. Ist dies erreicht, kann die Desorption mittels repetitivem Laserbeschuss gestartet werden. Hierbei sollte die Wellenlänge der Laseremission mit dem Absorptionsmaximum des Matrixmoleküls abgestimmt sein. Der Laserstrahl durchläuft einen Strahlteiler, so dass die Desorption der Probe zeitgleich mit der Zeitmessung gestartet werden kann. Das Flugzeitspektrometer wird vor der Messung des/der Analyten mit einer Auswahl an geeigneten Standardproben in dem relevanten Massenbereich kalibriert.

In der MALDI-TOF-MS ist die Flugzeit dem Quotienten aus Masse/Ladung proportional ( t ~ √m/z). Bei der Mehrheit der in der Tabelle enthaltenen Matrixsubstanzen wird mit niedrigen pH-Werten gearbeitet, so dass man positiv geladene Molekülionen erhält. In der Regel werden hierbei einfach geladene Molekülionen vom Typ [M+H]+ beobachtet. Bei einigen Matrices (z.B. Sinapinsäure) treten jedoch auch die zweifach oder dreifach geladenen Ionen ( [M+2H]2+ , [M+3H]3+ ) oder Dimere ( [2M+H]+ ) auf. Die Präzionsangaben liegen im Bereich von +/- 0.01 - 0.1 %. Die Messergebnisse werden als Intensitätsänderung der Signale als Funktion von m/z in atomaren Masseneinheiten (amu, engl. "atomic mass units") angegeben.

Tab.1
In der MALDI-TOF-MS verwendete Matrixsubstanzen, Eigenschaften und Verwendung
MatrixmaterialWellenlänge/eingesetztes Puls-LasersystemNachweis von
Nicotinsäure266 nm,frequenz-vervierfachter Nd:YAG-LaserOligonucleotiden
2,5-Dihydroxy-benzoesäure (Gentisinsäure)337 und 355 nm, Stickstoff-Laser, frequenz-verdreifachter Nd:YAG-LaserPolypeptiden, Kohlenhydraten
4-Hydroxy-picolinsäure337 und 355 nm, Stickstoff-Laser, frequenz-verdreifachter Nd:YAG-LaserOligonucleotiden
Sinapinsäure337 und 355 nm, Stickstoff-Laser, frequenz-verdreifachter Nd:YAG-LaserPolypeptiden und Proteinen
α-Cyano-4-hydroxy-zimtsäure337 und 355 nm, Stickstoff-Laser, frequenz-verdreifachter Nd:YAG-LaserPeptiden und Polypeptiden
Succinat2,94 µm, 10,6 µm, CO2-Laser, Er:YAG-LaserSynthetischen Polymeren
Glycerol (flüssig)2,94 µm, 10,6 µm, CO2-Laser, Er:YAG-LaserPolypeptiden, Proteinen
4-Hydroxy-benzyliden-malonsäure-dinitril337 und 355 nm, Stickstoff-Laser, frequenz-verdreifachter Nd:YAG-LaserLipiden und Lipoiden
Terthiophen337 und 355 nm, Stickstoff-Laser, frequenz-verdreifachter Nd:YAG-LaserLipiden und Lipoiden
Hinweis
Einige Strukturformeln der angegebenen Matrixsubstanzen findet man in der Lerneinheit MALDI-TOF-MS.
Abb.2
Handhabung eines MALDI-TOF im Proteinlabor
© Wiley-VCH
Hinweis
Die Methode der MALDI-TOF-MS wurde von den Arbeitsgruppen von Karas und Hillenkamp entwickelt und 1987 erstmals berichtet. Nahezu zeitgleich entstand in Japan in der Gruppe von Tanaka ein ähnliches Verfahren. Die MALDI-TOF-MS hat im Laufe der letzten beiden Dekaden in der Bioanalytik eine herausragende Bedeutung erlangt. Nicht zuletzt deshalb wurde ihre Entwicklung mit dem Nobelpreis für Chemie im Jahre 2002 gewürdigt.

Literatur

Camara-Artigas, A.; Brune, D.; Allen, J. (2002): Interactions between lipids and bacterial reaction centers determined by protein crystallography. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 99 , 11055-11060
Karas, M.; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. (1987): Matrix-assisted ultraviolet laser desorption of non-volatile compounds. In: Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc.. 78 , 53-68
Overberg, A.; Karas, M.; Bahr, U.; Kaufmann, R.; Hillenkamp, F. (2005): Matrix-assisted infrared-laser (2.94 µm) desorption/ionization mass spectrometry of large biomolecules. In: Rapid Com. Mass Spectrom.. Ion Proc.. 4 , 293-296
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T.; Matsuo, T. (1988): Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. In: Rapid Com. Mass Spectrom.. 2 , 151-153

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