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Mikroskopische Methoden

Elektronenmikroskopie

Elektronenmikroskope benutzen anstelle von Licht einen Strahl hochenergetischer Elektronen, der durch metallische Blenden und magnetische Linsen fokussiert werden kann. Sie wurden entwickelt, um die Limitationen der Lichtmikroskope (LM) in Vergrößerung und Auflösung zu überwinden. Da die Auflösung (minimaler Abstand zweier gerade noch unterscheidbarer Punkte, ρ) von der Wellenlänge (λ) der eingesetzten elektromagnetischen Strahlung abhängt, ergibt sich nach dem Rayleigh-Kriterium, das sowohl für inkohärentes Licht als auch Elektronenstrahlen gilt:

ρ = 0.61 λ sin α

wobei α für den durch Aberrationen (Fehler) der Linsen verursachten Winkel zwischen dem einfallenden und ausfallenden Strahl steht (Konvergenz-Winkel).

Als Faustregel gilt, dass zwei Gegenstände nicht mehr getrennt wahrgenommen werden können, falls ihr Abstand kleiner als die Wellenlänge der eingesetzten elektromagnetischen Strahlung ist. Bei der Wellenlänge von sichtbarem Licht (400-700 nm) kann so eine maximal 500- bis 1000-fache Vergrößerung bei einer Auflösung von maximal 0,2 mm erreicht werden.

Jenseits des unteren Endes des sichtbaren Spektrums befinden sich Röntgen- und Gammastrahlung mit geringeren Wellenlängen. Durch deren hohe Energie wären jedoch äußerst leistungsstarke Linsen zur Bündelung des Strahls in einem Mikroskop erforderlich. Da bis heute solche Linsen nicht hergestellt werden können, beschränkt sich der Einsatz von Röntgenstrahlung auf die Kristallanalyse. 1923 wies der französische Physiker de Broglie nach, dass sich die Wellenlänge eines Teilchens indirekt proportional zu dessen Impuls (p) verhält:

λ = h p = h m v = h ( 2 e V m )

wobei m und v der relativistischen Masse und Geschwindigkeit entspricht und h der Planck'schen Konstante (Planck'sches Wirkungsquantum: 6 ,626 10 -34 Js) entspricht.

Dadurch wurde deutlich, dass Elektronenstrahlen wesentlich geringere Wellenlängen und damit höhere Auflösungen in Mikroskopen als sichtbares Licht erreichen können, wenn geeignete Linsensysteme gefunden werden könnten. Der Durchbruch gelang 1927 durch den deutschen Physiker Hans Busch, der zeigen konnte, dass Elektronenstrahlen analog zu den optischen Linsen beim Licht durch magnetische Spulen gebündelt werden können. Bereits fünf Jahre später (1932) gelang dem 1986 mit dem Nobelpreis ausgezeichneten deutschen Physiker Ernst Ruska (Nobelpreis für Physik 1986) gemeinsam mit Max Knoll der Bau des ersten brauchbaren Transmissions-Elektronenmikroskops (TEM).

Abb.1
Aufbau der Licht-, Transmissions-Elektronen- und Raster-Elektronen-Mikroskopie

Abbildung 1: Prinzipieller Aufbau der Licht- (LM), Transmissions-Elektronenmikroskope (TEM) und Raster-Elektronenmikroskope (scanning electron microscope, SEM). Bei beiden elektronenmikroskopischen Verfahren muss die Probe in das Vakuum der Anlage eingeschleust werden!

Das größte Problem der EM ist die Zerstörung der Probe durch das Vakuum innerhalb der Anlage - vor allem aber durch die Einwirkung des energiereichen Elektronenstrahls. Um diese Zerstörung möglichst gering zu halten, müssen relativ geringe Elektronendosen eingesetzt werden. Dies jedoch führt im Gegenzug zu Aufnahmen mit einem ungünstigen Rauschabstand (signal-to-noise ratio), die nur über Mittelungen geglättet werden können. Die Cryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM) ist ein Spezialverfahren, bei dem eine Probe mittels eines flüssigen Kühlmittels vor der Untersuchung sehr rasch durchgefroren wird. Dadurch wird die Probe geschützt und es können höhere Strahlungsdosen eingesetzt werden. Ein weiterer Vorteil der Cryo-EM besteht darin, dass biologische Moleküle in Lösung untersucht werden können, die zuvor schockgefroren wurden.

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