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Proteindynamik: Myoglobin und Hämoglobin

Strukturelle Dynamik des Myoglobin-Moleküls im Detail

Die Dynamik des Myoglobin-Moleküls wurde intensiv in Flash-Photolyse-Experimenten an Wildtyp- und gezielt verändertem Protein untersucht. Sämtliche Ligand-Mb- Komplexe, wie MbO2, MbCO oder MbNO, sind photosensitiv, d.h., dass ein kurzer intensiver Laser-Puls zu einem Bindungsbruch, zur Freisetzung des Liganden und zur Relaxation des Proteins führt. Wie bereits in der Lerneinheit Sauerstofft-Tansport im Muskel und im Blut dargestellt wurde, fungieren CO und NO wahrscheinlich als Signalüberträger im Säugerorganismus, und daher sind derartige experimentelle Untersuchungen auch von physiologischer Relevanz. Regt man also CO-gebundenes Myoglobin (MbCO) mit einem Laserblitz (frequenz-verdoppelter Nd-YAG-Laser, λ=532 nm; Absorptionsbanden von Häm [Fe2+/Fe3+]: 400-500 nm (Soret-Banden), 500-600 nm: αβ-Banden, π→π* Übergänge) an, so kommt es kurzzeitig zu einer Dissoziation des CO, bevor der Ligand erneut gebunden wird oder in das umgebende Lösungsmittel übertritt. Permanent ist kein Kanal vorhanden, durch den das CO das Myoglobin verläßt. Vielmehr werden transient Hohlräume im Myoglobin gebildet, durch die der Ligand nach außen gelangen kann. Hierzu benötigt ein CO-Molekül weniger als 1 µs. Eine weitere Methode, dynamische Prozesse im Mb zu studieren, ist die zeitaufgelöste Röntgen-Kristallographie, mit der Schotte et al. (2003) ein kurzlebiges CO-Mb-Intermediat (Lebensdauer: 140 ps!) identifizierten. Bei physiologischen Temperaturen erfolgt die Photolyse des CO-Myoglobin offenbar über mehrere transiente Intermediate, die man mit Hilfe des sequentiellen Reaktionsmodels allg. beschreiben kann:

Abb.1

A: Liganden-gebundene Form MbCO; S: photodissoziierte Form, bei der CO in das Lösungsmittel übergegangen ist (S =engl. solvent) . B, C und D sind intermediäre Zustände, in denen CO an verschiedene Stellen im Protein bindet; der Zustand DR tritt auf, wenn Myoglobin seine Konformation ändert. Die Bildung der kovalenten Bindung am Fe ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt (B →A). Abb. nach: Frauenfelder & McMahon, 2001; Fraunfelder et al. (2001).

Das Konzept der Energielandschaft

Als über die Faltung von Proteinen noch wenig bekannt war, herrschte die Ansicht vor, dass sich die Aminosäure-Kette in eine einzige korrekte Tertiärstruktur faltet. Wie man heute weiß, ist diese Vorstellung viel zu einfach. Heute spricht man eher von einer Energielandschaft, die verschiedene Täler hat (Energieminima). Jede mögliche Konformation eines Proteins entspricht dabei einem dieser Täler, die durch bestimmte Energiebarrieren voneinander getrennt sind. Der native Zustand eines Proteins bildet ein tiefes Minimum in der Energielandschaft (s. hierzu auch das Trichtermodell in der Lerneinheit Proteinfaltung). Innerhalb des energetisch am tiefsten liegenden Zustandes gibt es eine Vielzahl von Subzuständen, die zwar nur leicht unterschiedliche Konformationen aufweisen, jedoch durchaus größere funktionelle Divergenzen zeigen können. Dieses gilt auch für Myoglobin: Die Zustände A bis D sind quasi Täler in einer Energielandschaft, wobei sich das CO-Molekül jeweils an verschiedenen Positionen im Myoglobin befindet.

Abb.2

Jeder Zustand (A bis D) stellt ein lokales Energieminimum dar (Abb. nach: Fraunfelder & McMahon, 2001).

Molekulare Vorgänge bei der blitz-induzierten Dissoziation von MbCO- Vergleichend ist die NO-Beweglichkeit im Mb gezeigt

Wenige Picosekunden nach der Photodissoziation befindet sich das CO-Molekül zunächst parallel zur Häm-Ebene, 3.6 Å entfernt vom Metallzentrum (so genannte primary docking site oder distalen Häm-Tasche, assoziiert mit Zustand B). Von dort kann es in andere Hohlräume des Myoglobins wandern, die durch Xe-Bindungsstudien mittels Röntgenbeugung an Proteinkristallen bei tiefen Temperaturen entdeckt wurden (diese Hohlräume werden entsprechend auch als Xenon cavities bezeichnet). Gleichzeitig tritt das Fe, das zuvor in der Häm-Ebene gelegen hat, aus der Häm-Ebene heraus (heme doming, Häm-Wölbung).

Abb.3

Myoglobin: mögliche Zustände; Schematische Darstellung der Bewegung des CO-Moleküls durch das Myoglobin, bevor CO in die Umgebung entlassen wird (Zustand S).

Abb.4

Cartoon des aktiven Zentrums von MbO2: NO wird wie CO schwach in den Xe-Bindungstaschen gebunden. Bevorzugt wird zunächst Xe1 besetzt, bevor der Ligand in Richtung Xe4 wandert und dort Gelegenheit hat, zu reagieren.

Diese Schritte finden auch bei sehr niedrigen Temperaturen statt, während die nun folgenden Fluktuationsbewegungen bei Temperaturen unter 180 K ausbleiben.

  • Im Zustand C ist das CO im Xe4-Hohlraum gebunden, der am hinteren Ende der distalen Häm-Tasche liegt.
  • Das CO-Molekül wandert weiter zum Xe1-Hohlraum (Zustand D), der sich auf der proximalen Seite des Häms befindet (Abb. 4) .
  • Der Übergang D -> DR ist auf eine Bewegung des Myoglobins selbst zurückzuführen. Mit der Freisetzung von CO in das umgebende Lösungsmittel (Zustand S) können auch Wasser-Moleküle zur CO-Bindestelle gelangen.
Abb.5
Reprinted by permission from Nature (A. Ostermann, R. Waschipky, F. G. Parak, G. U. Nienhaus, Nature 2000, 404, 205-208). Copyright (2000) Macmillan Publishers Ltd.

MbCO vor der Photodissoziation. Das Fe liegt in der Häm-Ebene (Bildmitte).

Abb.6
Reprinted by permission from Nature (A. Ostermann, R. Waschipky, F. G. Parak, G. U. Nienhaus, Nature 2000, 404, 205-208). Copyright (2000) Macmillan Publishers Ltd.

Photodissoziation bei Temperaturen < 180 K. Der Pfeil zeigt auf das CO-Molekül.

Abb.7
Reprinted by permission from Nature (A. Ostermann, R. Waschipky, F. G. Parak, G. U. Nienhaus, Nature 2000, 404, 205-208). Copyright (2000) Macmillan Publishers Ltd.

Photodissoziation bei Temperaturen > 180 K. Der Pfeil oben rechts zeigt auf ein neues Molekül (vermutlich Wasser), der Pfeil unten links auf das CO im Xenon1-Hohlraum. Zum Vergleich in Blau eingezeichnet ist die Position der Aminosäuren vor der Photodissoziation. Die Myoglobin-Helices B, C und E haben sich deutlich verlagert.

Literatur

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Stoddard, B. L. (1998): New results using Laue diffraction and time-resolved crystallography. In: Current Opin. Struct. Biol.. 8 , 612-618

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