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Circulardichroismus und Proteinstruktur

Circulardichroismus von Proteinen

Zur detaillierten Struktur-Analyse von Proteinen werden in der Regel die hochauflösende Röntgenstrukturanalyse von geeigneten Kristallen oder die NMR Spektroskopie eingesetzt. Beide Methoden haben allerdings den Nachteil, dass große Probenmengen benötigt werden und die Analysen äußerst zeit- und arbeitsintensiv sind. Ferner ist bei der NMR-Spektroskopie die Isotopen-Markierung der Proteine mit N15, C13 oder H2 äußerst kostspielig. Die vollständige Strukturanalyse mittels NMR ist bislang nur bei Proteinen bis zu einer Molmasse von ca. 35 kDa gelungen. Viele Proteine lassen sich nicht ohne Weiteres kristallisieren oder stehen nicht in großen Mengen zur Verfügung, so dass eine CD-Kristallisation durchgeführt werden kann. Einfachere und erheblich schnellere Untersuchungen zur allgemeinen Konformation eines Proteins sind mittels CD-Spektroskopie möglich.

Allgemein werden CD-Messungen an Proteinen durchgeführt, um

  • den Gehalt an Sekundärstrukturelementen (α-Helix, β-Faltblatt) und Schleifenbereichen zu analysieren,
  • Konformationsänderungen zu beobachten, z.B.
    • bei der Bindung eines Liganden,
    • bei Protein/Protein-Wechselwirkungen,
    • bei der Rückfaltung denaturierter Proteine,
    • bei Faltungsvorgängen und
    • zur Bestimmung der Stabilität eines Proteins in bestimmten Puffern oder unter bestimmten Bedingungen, sowie um
  • Proteine aus verschiedenen Quellen zu vergleichen, also z.B. um zu überprüfen, ob ein rekombinant, d.h. gentechnisch hergestelltes Protein die gleiche Konformation aufweist wie das native Ausgangsprotein oder ob sich verschiedene Proteinpräprationen hinsichtlich ihrer Konformation unterscheiden.

CD-Signale von Proteinen treten vor allem in zwei Spektralbereichen auf. Signale im kurzwelligen UV-Bereich von 170 bis 250 nm (der so genannten Amid-Region) sind vor allem auf die Peptidbindung zurückzuführen, während die Signale im langwelligen UV-Bereich von 250 bis 300 nm von den aromatischen Aminosäuren stammen. Zudem geben Disulfid-Brücken Signale bei 250 nm (vide infra unter SCRD).

1. Der ferne UV-Bereich (170 bis 250 nm)

Die CD-Spektren im fernen UV-Bereich können verwendet werden, um den Anteil bestimmter Sekundärstrukturelemente im Protein zu bestimmen. Die α-helicalen Bereiche geben eine stark ausgeprägte, sehr charakteristische Bande im kurzwelligen UV-Bereich, während andere Sekundärstrukturelemente, wie z.B β-Faltblätter, etwas weniger deutliche Signale geben.

Abb.1
CD-Spektren von Poly-L-Lysin

Das CD-Spektrum der Sekundärstrukturelemente α-Helix, β-Faltblatt und "random coil" (am Beispiel Poly-L-Lysin).

2. Der nahe UV-Bereich (250 bis 300 nm)

Obwohl es sehr schwierig ist, aus CD-Spektren Einzelheiten über die Struktur eines Proteins oder die unmittelbare Umgebung einer aromatischen Aminosäure abzulesen, gibt gerade auch das längerwellige UV-Spektrum sehr gute Anhaltspunkte für eine korrekte, d.h. native Faltung eines Proteins. So lässt sich z.B. das CD-Spektrum eines rekombinanten, renaturierten Proteins mit dem des nativen Proteins vergleichen, um festzustellen, ob die Renaturierung vollständig abgelaufen ist. Aromatische Aminosäuren geben in der Nähe ungeordneter Strukturbereiche, wie sie in kurzen Peptiden häufig vorkommen, nur ein schwaches Signal. Ist ein Protein vollständig entfaltet, so ist das CD-Signal der Aromaten praktisch gleich Null.

CD-Signale der aromatischen Aminosäuren:

  • Phenylalanin, maximale Absorption bei 257 nm; ε = 200 [1/M x 1/cm]
  • Tyrosin, maximale Absorption bei 274 nm;ε = 1400 [1/M x 1/cm]
  • Tryptophan, maximale Absorption bei 280 nm; ε = 5600 [1/M x 1/cm]
Abb.2
CD-Spektren von nativem und rekombinantem Protein

Vergleich der CD-Spektren eines nativen Proteins (blau) mit einem nicht korrekt gefalteten rekombinanten Protein (rot).

Schematischer Aufbau eines Spektropolarimeters

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Abb.3
Aufbau

Gegebenfalls können die UV-Lampe und der Monochromator durch ein Lasersystem geeigneter Emissionswellenlänge ersetzt werden. Bei Verwendung von Synchrotron-Strahlung (SR) werden der Monochromator (M) und ein Polarisationsfilter (F) nicht benötigt, da SR linear polarisiert ist. Bei der Ausdehnung des Wellenlängenbereiches bis zu 1000 nm ist ein IR-sensitiver Detektor einzusetzen.

Methodisches

Für ein Spektrum im fernen UV werden je nach eingesetztem Küvettentyp etwa 20 bis 200 µL Lösung mit 1 mg/mL bis 50 µg/mL Protein benötigt. Der verwendete Puffer sollte nur eine minimale Eigenabsorption in dem für die Messung verwendeten Spektralbereich aufweisen. Daher sind beispielsweise Puffer, die Dithiothreitol (DTT), β-Mercapto-ethanol, EDTA1), Imidazol oder L-Histidin enthalten, nicht so geeignet. Die Konzentrationen der genannten Substanzen sollten kleiner als 1 mM sein. Bei Membranproteinen sind Detergentien auszuwählen, die möglichst in diesem Bereich nicht interferieren. Günstig sind z.B. einige glycosidische Tenside, wie n-Octyl-β-glycopyranosid. Ein häufig verwendeter Puffer enthält 10 mM Kaliumphosphat. Im UV-Bereich von 250 bis 270 nm (UV C) ist die Signalintensität erheblich geringer als im fernen UV-Bereich, so dass hier 1 mL Proteinlösung mit einer optischen Dichte OD280 von 0,5 bis 1 notwendig sind (diese OD entspricht bei den meisten Proteinen einer Konzentration von 0,25 bis 2 mg/mL). Enthält das Protein jedoch keine aromatischen Aminosäuren, empfiehlt es sich vorher eine Aminosäure-Analyse vorzunehmen oder eine geeignete Protein-Bestimmungsmethode, wie z.B. diejenige, die Bicinchoninsäure als Reagenz verwendet, zu wählen (siehe Literaturliste). Sämtliche CD-Messungen erfolgen unter einem permanenten Stickstoff-Strom. Dies ist notwendig, um die optischen Bauelemente des Spektropolarimeters, wie vor allem Spiegel, vor Ozon zu schützen, das aus dem Sauerstoff der Luft unter UV-Bestrahlung gebildet wird. Ferner absorbiert der molekulare Sauerstoff unterhalb von 195 nm. Daher gilt, dass die Flussrate an Stickstoff um so größer sein muss, je niedriger die Wellenlänge während der Messungen ist (bei Wellenlängen < 180 nm mehr als 50 L/min).Es ist zu empfehlen, vor der Messung eines Analyten, ein Referenzspektrum von Ammonium-D-10-Camphersulfonat durchzuführen (0.06 % (w/v) in wässrigem Lösungsmittel bei einer Messung in einer Küvette von 1 mm optischer Weglänge).

Spezielle Anwendungen

Viele Proteine enthalten Chromophore, wie Porphyrine, 2,3-Dihydroporphyrine (Chlorine), Carotinoide oder FAD als Cofaktoren oder prosthetische Gruppen. In diesen Fällen können auch CD-Messungen im VIS-Bereich (λ = 400-750 nm) durchgeführt werden. Beispiele hierfür sind Metalloproteine, wie Hämoglobin, Myoglobin, Cytochrome, Chlorophyll/Carotinoid-bindende Proteine der Photosysteme oder Flavoproteine. Aus derartigen Messungen lassen sich u.a. Aussagen treffen über excitonische Wechselwirkungen zwischen Chromophoren innerhalb eines Proteins oder zwischen denen verschiedener Pigment-Proteinkomplexe. Solche Interaktionen haben z.B. einen Einfluss auf das Auftreten, die relative Lage, die Intensität oder die Aufspaltung von CD-Banden. Siehe zu weiteren Anwendungsmöglichkeiten in der Lerneinheit Proteinfaltung.

Auswertung der CD-Spektren

Die gemessenen Spektren müssen im Anschluss dekonvolutiert werden, um die relativen Anteile an Sekundärstrukturelementen zu ermitteln. Die in den CD-Spektren enthaltenen Informationen können wie individuelle Spektren für die einzelnen Sekundärstrukturelemente des untersuchten Proteins behandelt werden. Zur Datenauswertung werden in der Regel Spektren von Proteinen bekannter 3D-Struktur als Referenz benutzt, die in Datenbanken vorliegen (The Protein Circular Dichroism Data Bank = PCDDB). DICHROWEB am Birkbeck College der Universität London ist ein Online-Server, der verschiedene Algorithmen bereitstellt, um CD-Spektren zu entfalten (Dekonvolution). Hierzu gehören die Analyse-Programme K2D, welches auf der Grundlage neuronaler Netzwerke arbeitet oder CONTINLL, welches auf dem von Provencher und Glockner entwickelten Algorithmus beruht (siehe Literaturliste).

Ausblick

Synchroton-Strahlung besitzt eine sehr viele höhere Intensität als üblicherweise in CD-Geräten verwendete Xenon-Bogenlampen (>1013 Photonen/sec). Mit Hilfe des so genannten SRCD (Synchroton Radiation Circular Dichroism) können Spektren bis in den Hochvakuum-UV-Bereich (120 bis 180 nm) mit größerer Genauigkeit gemessen werden als es bei herkömmlichen Labor-CD-Geräten der Fall ist. Ferner liefert die Ausdehnung in den VUV-Bereich neue Informationen über elektronische Übergänge im Proteinrückgrat (z.B. aus n → σ* Übergängen), die mit konventionellen CD-Geräten nicht detektierbar sind. Dabei besteht die Hoffnung, dass es zukünftig gelingt, verschiedene Helix-Formen, wie α-, 310- und π-Helices) unterscheiden zu können. Die bisherigen Analysen lassen hoffen, dass diese Ziele erreichbar sind. Biochemisch-analytische Untersuchungen haben ergeben, dass die höhere Strahlintensität und größere Energie der Synchrotron-Strahlung zumindest ausgewählte, gut charakterisierte Proteine, wie Myoglobin, nicht zerstört oder anderweitig molekular modifiziert.

Weitere Informationen zur Theorie und der Anwendung der SRCD bzw. Anwendung der Synchrotron-Strahlung zur strukturellen Analyse von Proteinen findet man z.B. beim Helmholtz-Zentrum Berlin (BESSY2), Proteinstrukturfabrik).

Literatur

Andrade, M. A.; Chacón, P.; Merelo, J. J.; Morán, F. (1993): Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism using an unsupervised learning neural network. In: Protein Eng.. 6 , 383-390
(1995): Biochemical Spectroscopy. In: Methods in Enzymol.. K. Sauer (Hrsg.). Academic Press
(1996): Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules. G. Fasman D. (Hrsg.). Plenum Press
Orry, A. J.; Janes, R. W.; Sarra, R.; Hanlon, M. R.; Wallace, B. A. (2001): Synchrotron radiation circular-dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures. In: J. Synchrotron Rad. . 8 , 1027-1029
Provencher, S. W.; Glockner, J. . (1981): Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism . In: Biochemistry. 20 , 33-37
Smith, P. K.; Krohn, R. I.; Hermanson, G. T.; Mallia, A. K.; Gartner, F. H.; Provenzano, M. D.; Fujimoto, E. K.; Goeke, N. M.; Olson, B. J.; Klenk, D. C. (1985): Measurement of protein using bicinchoninic acid . In: Anal. Biochem.. 150 , 76-85
Wallace, B. A. (2000): Synchrotron radiation circular-dichroism spectroscopy as a tool for investigating protein structures. In: J. Synchrotron Rad. . 7 , 289-295

Zugang zur PubMed-Datenbank

1)EDTA: Ethylendiamin-tetraessigsäure
2)BESSY: Berliner Elektronenspeicherring-Gesellschaft für Synchrotronstrahlung
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