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Proteinreinigung

Bestimmung der Proteinkonzentration: eine Einleitung

Die Bestimmung der Proteinkonzentration lässt sich mit einer ganzen Reihe verschiedener Verfahren durchführen:

  • gravimetrische Analysen (Kjeldahl)
  • quantitative Aminosäure-Analysen (Totalhydrolyse, Endgruppenbestimmung oder Edman-Abbau)
  • refraktometrische Analysen
  • Kolorimetrie
  • Spektrophotometrie bei 280 nm
  • densidometrische Methoden (aus Proteingelen etc.) nach Bindung eines Farbstoffes

Im Labor werden routinemäßig vor allem kolorimetrische oder direkte spektrophotometrische Verfahren eingesetzt, da diese in der Regel schnell und mit wenig Aufwand durchgeführt werden können.

Spektrophotometrie von Proteinen

Proteine lassen sich spektrophotometrisch nachweisen, da die aromatischen Aminosäurereste eine π-π*-Absorption bei 280 nm zeigen und die Peptidbindung bei 205 nm absorbiert. In beiden Fällen können allerdings zahlreiche Störfaktoren in der Probe das Ergebnis beeinflussen (z. B. Nucleinsäuren, Puffersubstanzen etc.), so dass die Konzentrationsbestimmung außer bei reinen Protein-Lösungen eher colorimetrisch durchgeführt wird. Die UV-Absorption eines Proteins kann erheblich variieren. Obwohl in der Praxis oft eine Extinktion von 1,0 bei 280 nm mit einer Proteinkonzentration von 1 mg/mL gleichgesetzt wird, stimmt dieses nur in wenigen Fällen mit der tatsächlichen Konzentration überein. Bei Lysozym hat eine 1 mg/mL- Lösung z.B. eine Extinktion von 2,7, Serum-Albumin hat eine Extinktion von 0,6 und Parvalbumin zeigt überhaupt keine Extinktion bei 280 nm. Die Peptidbindung absorbiert maximal bei 192 nm, ergibt aber auch bei 205 nm (50 % des Maximums oder eine OD von 31 bei 1 mg/mL Proteinlösung) und 225 nm (OD von 11 bei 1 mg/mL) noch gut messbare Werte. Hier ist besonders darauf zu achten, dass keine Kontaminationen vorhanden sind und auch der Puffer selbst nicht absorbiert.

Die spektrophotometrische Bestimmung der Proteinkonzentration ist vor allem dann vorteilhaft, wenn nur wenig Protein vorhanden ist und das Protein daher nicht denaturiert werden soll.

Kolorimetrische Verfahren

Auch die kolorimetrischen Verfahren haben ihre Vor- und Nachteile, denn die Sensitivität und der Aufwand schwankt beträchtlich zwischen diesen Methoden und mitunter wirken sich Bestandteile des Proteinpuffers störend aus. In allen Fällen wird das Protein denaturiert.

Tab.1
Zu den bekanntesten kolorimetrischen Verfahren gehören:
MethodePrinzip Sensitivität Anmerkung
Bradford-AssayDer Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G-250 bindet an aromatische und basische Aminosäurereste.0,2-20 µg Schnell, Störung durch manche Detergenzien (z.B. SDS) möglich.
Biuret-AssayDas Cu2+-Reagenz reagiert mit Peptidbindung.1-20 mg Schnell, aber wenig sensitiv. NH4+ und Tris stören die Reaktion.
BCA-AssayDas Cu2+-Reagenz reagiert mit Peptidbindung, Cu+ mit Bicinchoninat.0,2-50 µg NH4+ und EDTA stören die Reaktion. Keine Störung durch Detergenzien.
Lowry-AssayDas Cu2+-Reagenz reagiert mit der Peptidbindung, Phosphomolybdat (Phosphormolybdänsäure, H3[P(Mo12O40)]) und Phosphowolframat werden durch Tyr und Trp reduziert.2-100 µg Die Färbung ist langsam und der Farbstoff nicht stabil. NH4+ und Mercaptoethanol stören die Reaktion.
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