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Proteinreinigung

Die Isolierung von Proteinen aus Zellen oder Zellverbänden

Der erste Schritt einer Proteinaufreinigung wird in den meisten Fällen ein Zellaufschluss sein, durch den cytoplasmatische Proteine in Lösung gebracht werden oder die Isolierung der gewünschten Zellkompartimente (Membranfraktion, Organellen) ermöglicht wird. Hierzu existieren eine Reihe von Verfahren, die im Folgenden kurz vorgestellt werden:

1. Die osmotische Lyse

Zur Isolierung der Proteine müssen die Zellen zunächst lysiert (aufgebrochen) werden. Am einfachsten geschieht dies durch eine osmotische Lyse, bei der die Zellen in eine hypotonische Lösung gebracht werden. Wasser dringt in die Zellen ein und führt nach einiger Zeit zum Zerplatzen dieser Zellen. Dieses Verfahren liefert allerdings nur bei Erythrocyten bzw. Reticulocyten und bei sphäroplastierten Zellen eine vollständige Homogenisierung (s.u.).

2. Die enzymatische oder chemische Lyse

Enzymatische Verfahren sind die schonendsten Methoden zum Aufschluss von Bakterien und Hefen. Gerade bei Zellen, die eine Wand besitzen wie Pflanzenzellen oder Bakterienzellen, werden oft Enzyme eingesetzt, die diese Wände selektiv angreifen (Cellulasen; Lysozym bei bakteriellen Zellwänden). Die so entstehenden Sphäroplasten können dann durch osmotische Lyse, Detergenzien oder mechanische Verfahren weiter aufgearbeitet werden. Bei Hefen, deren Zellwand aus Glucanen aufgebaut ist, wird vor allem Zymolyase in Gegenwart von SH-Reagenzien verwendet; die Lyse der Zellen erfolgt dann z. B. durch 0,1 % Triton X-100 oder andere Detergenzien.

Detergenzien oder organische Lösungsmittel wie Toluol oder Aceton können zwar auch die Lyse von Zellen beschleunigen, führen aber u.U. zur Denaturierung der Proteine. Die Toluol-Lyse findet bei Raumtemperatur statt und führt dazu, dass die Zellwand permeabilisiert wird. Heute wird dieses wenig schonende Verfahren allerdings kaum noch verwendet.

3. Mechanischer Aufschluss

Zellen können auch mechanisch aufgeschlossen werden. Im einfachsten Fall bedeutet das Zermörsern mit Sand oder Alaunerde oder Zerkleinerung mit einem Homogenisator (einem Hochgeschwindigkeitsmixer), wobei darauf geachtet werden sollte, dass sich das Ausgangsmaterial nicht zu sehr erwärmt.

Sollen Proteine aus Organellen (Mitochondrien, Chloroplasten, Zellkernen) isoliert werden, trennt man zunächst diese Organellenfraktion durch eine Zentrifugation vom Rest der Zelle, bevor man die Organellen aufbricht. Auch durch diesen Schritt reduziert sich die Zahl der Proteine im Ausgangsmaterial erheblich.

Abb.1
Handelsüblicher Mixer
Abb.2
Die "French Press"

Bakterien lassen sich im Mixer oder Homogenisator nicht effizient aufschließen. Für die Proteinisolierung im kleinen Maßstab können z. B. Mörser und Schleifmittel (Al2O3, Sand) oder Glasmühlen verwendet werden. Größere Zellmengen können leicht mit Ultraschallgeräten zum Zerplatzen gebracht werden - auch hier ist besonders auf die mit dem Verfahren verbundene Temperaturerhöhung zu achten.

Häufig werden Zellsuspensionen von Bakterien oder eukaryontischen Einzellern auch in der French Press mit hohem Druck (bis zu 1000 atm, ca. 108Pa) lysiert, indem die Zellsuspension durch eine kleine Öffnung gepresst wird.

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