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Proteinreinigung

Die Kristallisation von Proteinen

Die Struktur vieler Proteine konnte erst mit der Röntgenstrukturanalyse von Kristallen aufgeklärt werden. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen wie Zucker oder Salze, die problemlos auskristallisieren und sehr regelmäßige Kristalle bilden, kristallisieren die oft sehr großen Protein-Moleküle mit ihrer unregelmäßigen dreidimensionalen Struktur nur unter ganz bestimmten Bedingungen, die in langen Versuchsreihen ermittelt werden müssen. Und - Proteinkristalle sind sehr fragil.

Die Kristallisation beginnt mit dem Protein in Lösung bei einer relativ hohen Proteinkonzentration von 5 bis 50 mg/mL. Dieser Lösung werden nun Reagenzien zugesetzt, die die Löslichkeit des Proteins langsam herabsetzen und zu einer spontanen Kristallisation führen sollen. Sind die Bedingungen optimal, bilden sich möglicherweise tatsächlich Kristallisationskeime, von den aus das Wachstum des Proteinkristalls fortschreiten kann. In der Praxis sieht es so aus, dass man in einem ersten Screening eine Reihe von Bedingungen austestet. Manchmal bilden sich relativ schnell die ersten Kristallisationskeime, oft muss man aber Wochen oder sogar Monate warten. Falls sich Bedingungen finden lassen, bei denen Kristallisationskeime gebildet werden, werden diese Bedingungen systematisch optimiert. Ein brauchbarer Kristall sollte in mindestens zwei Raumdimensionen 0,2 bis 0,4 mm groß sein.

Es gibt zwei grundsätzlich verschiedene Methoden zur Kristallisation, die sitting drop- und die hanging drop-Methode. Bei der hanging drop-Methode werden ein paar Mikroliter der Protein-Lösung mit einem gleichen Volumen einer Reservoir-Lösung gemischt, die das Präzipitationsmittel enthält. Ein Tropfen dieser Mischung wird auf einen Glasträger gegeben, der das Reservoir bedeckt. Da die Lösung im Reservoir eine höhere Konzentration des Präzipitationsmittels enthält als der Tropfen (der ja ein Gemisch mit Protein ist), tritt im Laufe der Zeit Wasser von dem Tropfen in das Reservoir über und sowohl die Proteinkonzentration als auch die Konzentration des Präzipitationsmittels im Tropfen erhöht sich sukzessive. Dieser Vorgang wird oft über Wochen und Monate mikroskopisch verfolgt, immer in der Hoffnung, dass sich spontan Kristallisationskeime bilden. Diese Vorgehensweise ist heute automatisiert und so genannte Screening Kits mit einer großen Anzahl verschiedener Präzipitationsmittel sind kommerziell erhältlich.

Abb.1

Proteinkristallisation mit der hanging drop-Methode

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