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Proteinreinigung

Die Gelelektrophorese

Die Nettoladung eines Proteins, die molekulare Masse und die Konformation bedingen die Wanderungsgeschwindigkeit dieses Proteins im elektrischen Feld. Dieses macht man sich bei der Gelelektrophorese zunutze, bei der die freie Bewegung der geladenen Proteine durch die Gelmatrix behindert wird. Elektrophoretische Verfahren werden allerdings eher zur Analyse von Proteinen verwendet als zu ihrer Isolierung. In der Gelelektrophorese lässt sich z.B. die molekulare Masse eines Proteins abschätzen oder der Reinheitsgrad einer Proteinpräparation bestimmen.

Für die Elektrophorese von Proteinen werden hauptsächlich Gele aus dem vernetzten Polymer Polyacrylamid verwendet. Dieses Polymer wirkt wie eine Art Molekularsieb: in einem elektrischen Feld werden die Proteine in etwa proportional zu ihrer molekularen Masse in ihrer Wanderung durch das Gel verlangsamt. Soll ein Protein nur nach seiner Größe und nicht nach seiner Ladung aufgetrennt werden, wird das Detergens Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate, SDS) zugesetzt. SDS bindet die meisten Proteine in etwa proportional zur molekuaren Masse. Das gebundene SDS verursacht also eine hohe negative Nettoladung unabhängig von der Eigenladung des Proteins. Zudem wird die native Konformation des Proteins durch dieses Detergens verändert, so dass die Proteine alle eine mehr oder weniger ähnliche Konformation im Gel aufweisen. Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) trennt Proteine also nur nach molekularer Masse auf.

Bei der nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese wird kein SDS zugesetzt, die Proteinauftrennung im Gel erfolgt also nach molekularer Masse, Konformation und Ladung. Obwohl Proteine oft nicht direkt zu vergleichen sind, hat diese Methode den Vorteil, dass die Aktivität eines Proteins i.d.R. erhalten bleibt.

Nach Beendigung der Elektrophorese werden die Proteine angefärbt, um sie sichtbar zu machen.

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