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Immunologische Verfahren

Enzym-gekoppelter Immunoadsorptionsassay (ELISA)

engl. enzyme-linked immunosorbent assay

Definition
Im Unterschied zum RIA wird beim ELISA ein Ligand verwendet, der nicht radioaktiv markiert, sondern an ein Enzym (z.B. eine Peroxidase) gekoppelt ist.

In der Praxis wird der Antikörper gegen das nachzuweisende Antigen zunächst auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Nach der Blockierung unspezifischer Bindungsstellen wird das Antigen hinzugefügt und gebunden. Im nächsten Schritt wird ein weiterer, gegen das Antigen gerichteter Antikörper hinzugegeben, der mit einem Enzym gekoppelt ist (z.B. ein anti-Maus-IgG, das mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist). Zugabe eines Substrates (z.B. o-Phenylendiamin für die Peroxidase) setzt die Enzymreaktion in Gang, bei der in den meisten Fällen ein farbloses Substrat in ein farbiges Produkt überführt wird. Die entsprechenden Produkte werden dann kolorimetrisch bestimmt.

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Abb.1
Prinzip des Enzym-gekoppelten Immunoadsorptionsassays (ELISA)

Beim Sandwich-ELISA wird das Protein (das Antigen) immobilisiert, dann der erste (primäre) Antikörper hinzugefügt, der spezifisch an das Antigen bindet. Überschüssiger Antikörper wird durch Waschschritte entfernt, dann ein zweiter, gegen den primären Antikörper gerichteter Antikörper (der sekundäre Antikörper) zugegeben. Mit dem sekundären Antikörper ist ein Enzym konjugiert; häufig handelt es sich dabei um die Meerrettich-Peroxidase. Das Enzym bildet einen Komplex mit Wasserstoffperoxid und ist daher in der Lage, organische Substrate zu oxidieren. Als besonders geeignetes Substrat hat sich Azino-bis-(3-ethylbenzthioazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz (ABTS) erwiesen, das in ein wasserlösliches, grünes Zwischenprodukt übergeht, dessen Konzentration photometrisch bestimmt werden kann (Absorptionsmaxima bei 410 und 650 nm).

Abb.2
Film zum ELISA
© Wiley-VCH
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