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Immunologische Verfahren

Immunopräzipitation

Antigen und Antikörper präzipitieren, wenn beide Interaktionspartner in annähernd gleichem Verhältnis zueinander vorhanden sind. Auf dieser Tatsache basieren die verschiedenen Verfahren der Immunopräzipitation, die bei bekannter Konzentration von entweder Antigen oder Antikörper eine Abschätzung der Konzentration des anderen Interaktionspartners erlauben oder auch Aussagen über die Identität von Antigenen bzw. Antikörpern ermöglichen (Abb. 1) . Die Immunopräzipitation kann in Lösung erfolgen, dann wird die Konzentration des Präzipitats anhand der Trübung der Lösung photometrisch bestimmt. Gebräuchlicher ist allerdings die Immunpräzipitation im Gel, bei der Präzipitate entstehen, die sich entweder direkt (wenn die Konzentration des Präzipitats hoch genug ist) oder nach Anfärben des Gels z.B. mit Coomassie brilliant blue quantifizieren lassen.

Abb.1
Immunpräzipitation

Immunodiffusion im Gel: Radiale Diffusion

Eine Reihe von Antigen-Verdünnungen werden in Löcher pipettiert, die in ein 1-2 %iges Agarose-Gel, das den Antikörper enthält, gestanzt wurden. Das Antigen diffundiert nun radial in das Gel und bildet Präzipitationslinien, wo sich Antigen- und Antikörperkonzentration annähernd entsprechen. Anhand von Standardkurven kann nun die Konzentration des Antigens quantifiziert werden.

Immunodiffusion im Gel: Doppeldiffusion

Bei der Doppeldiffusion lassen sich unterschiedliche Antikörper-Populationen in einem Serum nachweisen und der Verwandtschaftsgrad verschiedener Antigene bestimmen. Antigen und Antikörper werden dazu in verschiedene Löcher eines Agarose-Gels pipettiert und diffundieren aufeinander zu. An der Stelle im Gel, wo die Konzentrationen in etwa äquimolar sind, bilden sich Präzipitationslinien, die anhand von Standardkurven ausgewertet werden können. Wenn die Antigen-Lösung zwei (oder mehr) Antigene unterschiedlicher Größe enthält, bilden sich zwei bzw. mehrere Präzipitationslinien.

Immunodiffusion im Gel: de Ouchterlony-Assay

Der Ouchterlony-Assay ist im Prinzip eine Doppeldiffusionsmethode, bei der der Antikörper in ein Loch in der Mitte eines Agarose-Gels pipettiert wird und verschiedene Löcher mit Antigen-Lösungen kreisförmig um diesen Antikörper angeordnet sind. Mit diesem Test lässt sich anhand der Präzipitationslinien zeigen, ob ein Antikörper verschiedene Antigene erkennt bzw. ob verschiedene Antigene ganz oder teilweise identisch sind.

Säulenchromatographische Immunopräzipitation

Die Immunpräzipitation kann auch eingesetzt werden, um Antikörper ähnlich wie in der Affinitätschromatographie zu isolieren. Hierzu wird das Antigen (= Ligand) an das Säulenmaterial (z.B. Sepharose) gekoppelt. Wird nun ein Serum mit verschiedenen Antikörpern über die Säule gegeben, kann nur der Antikörper binden, der das spezifische Epitop des Antigens erkennt. Durch Änderung des pH-Wertes oder der Ionenstärke des Puffers kann der gebundene Antikörper wieder aus dem Komplex freigesetzt werden. IgG-Antikörper lassen sich säulenchromatographisch isolieren, wenn Protein A- oder Protein-G-Sepharose verwendet wird. Diese beiden Proteine, die von Staphylococcen (Zellwandprotein A) bzw. von Streptococcen (Protein G) gebildet werden, binden an die konstanten Fc-Regionen der IgG-Moleküle.

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