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Chromatographie von Proteinen

Historisches zur HPLC

Bei den ersten Chromatographie-Methoden zur Auftrennung niedermolekularer Substanzen mit Hilfe der Schwerkraft traten schnell eine ganze Reihe von Problemen auf. So konnte z.B. keine gute Auflösung erreicht werden, denn diese wird sehr stark durch die Diffusion während der Chromatographie beeinträchtigt. Die Diffusion wiederum hängt ab von der Dauer des Experiments: je schneller eine Chromatographie durchgeführt werden kann, desto weniger fällt die Diffusion ins Gewicht und desto schärfer ist die Auftrennung. Um die Chromatographie zu beschleunigen, wurde anstatt mit der Schwerkraft nun mit Druck gearbeitet. Damit traten allerdings weitere Probleme auf - je schneller das Laufmittel fließt, desto kleiner müssen die Partikel des Säulenmaterials sein, da sonst die Substanzen in der Probe nicht lange genug Zeit haben, in die Partikel einzudringen und an diese zu binden. Je kleiner aber die Partikel des Säulenmaterials sind, desto höher wird der Gegendruck im System. Viele dieser Probleme wurden durch die Entwicklung von leistungsfähigen Pumpsystemen und druckstabilen Verbindungen in den 70iger Jahren behoben - die ersten HPLC-Systeme waren damit geboren. Die HPLC (ursprünglich high pressure liquid chromatography) wurde zunächst nur für die Reinigung kleinerer Moleküle an hydrophoben Säulenmaterialien mit organischen Lösungsmitteln (z.B. Methanol oder Acetonitril in wässriger Lösung) eingesetzt.

Protein-Aufreinigung über HPLC

Die ersten HPLC-Systeme waren für die Aufreinigung von Proteinen nicht geeignet. Die Poren des Säulenmaterials waren so klein, dass die meisten Proteine kaum oder nur langsam in das Säulenmaterial eindringen konnten, was wiederum ein Absenken der Fließgeschwindigkeit erforderte. Die größten Probleme bereiteten die üblicherweise verwendeten Laufpuffer, denn die meisten Proteine denaturieren in Puffern, die bis zu 50 % organisches Lösungsmittel enthalten.

Für die Chromatographie von Proteinen wurde das HPLC-System erneut verändert und wird heute daher eher mit dem Begriff high performance liquid chromatography bezeichnet, da hier weniger der hohe Druck als die hohe Qualität der Materialien im Vordergrund steht. HPLC wird auch oft als Sammelbegriff verwendet, der nicht nur die Methode, sondern auch die technische Ausrüstung, die Pumpen, Mixer, Säulen, Detektoren und Datenprozessoren umfasst.

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