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Chromatographie von Proteinen

Dünnschichtchromatographie

Papier- und Dünnschichtchromatographie (auch thin layer chromatography oder TLC genannt) sind Verfahren, die heute vor allem semipräparativ verwendet werden. Als stationäre Phase dient in diesem System solvatisiertes Papier oder ein entsprechendes Dünnschicht-Material (z.B. Kieselgel, Cellulose-Derivate oder Al2O3), das auf einem Träger wie einer Glas- oder Kunststoffplatte aufgetragen ist. Als mobile Phase dient ein organisches Laufmittel, das sich kapillar durch die stationäre Phase bewegt. Mit geeigneten Methoden werden die unterschiedlichen Bestandteile des Probengemisches sichtbar gemacht (wenn diese nicht farbig sind) und mit geeigneten Vergleichssubstanzen verglichen.

Die Proben werden am Boden der Platte punktförmig aufgetragen und die Platte in einem (meist geschlossenen) Behälter entwickelt (Abb. 1) . Die Kammer ist etwa 1 cm hoch mit einem Laufmittel gefüllt, das langsam die Platte empor steigt und die Probenbestandteile, je nach Verteilungskoeffizient, mehr oder weniger gut mittransportiert. Der Lauf ist beendet, wenn die Lösungsmittelfront den oberen Rand der Platte fast erreicht hat.

Abb.1
Dünnschichtchromatographie

Experimentelle Anordnung zur Papier-Chromatographie

Auswertung einer Dünnschichtchromatographie

Das chromatographische Verhalten einer Substanz wird durch den Rf-Wert beschrieben, der wie folgt berechnet wird:

Rf = Wanderungsstrecke der Substanz / Wanderungsstrecke des Laufmittels

Der Rf-Wert hängt von der Art des Dünnschichtmaterials und dem verwendeten Laufmittel ab. Die Trennschärfe hängt vor allem von der Partikelgröße des Dünnschichtmaterials ab. Eine Dünnschichtchromatographie mit besonderen Platten kleiner Korngröße (5 mm) und enger Kornbandbreite wird als high performance thin layer chromatography (HPTLC) bezeichnet. Komplexere Proben können auch mit einer zweidimensionalen TLC analysiert werden. Dabei werden die Proben zunächst in einem Laufmittel aufgetrennt und die DC-Platte nach dem Trocknen um 90° gedreht, bevor eine zweite Chromatographie in einem anderen Laufmittel durchgeführt wird.

Die Wanderungsstrecke gefärbter Substanzen lässt sich direkt ablesen, während ungefärbte Substanzen erst durch spezielle Färbeverfahren sichtbar gemacht werden müssen. Proteine werden üblicherweise durch das Besprühen der Dünnschichtplatten mit Ninhydrin angefärbt (Ninhydrin-Reaktion).

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