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Chromatographie von Proteinen

Matrix und Liganden für die Affinitätschromatographie

Die Liganden

Soll ein Protein, eine Nucleinsäure oder ein Hormon über Affinitätschromatographie isoliert werden, muss ein spezifischer Ligand existieren, der kovalent an die Matrix des Säulenmaterials gebunden werden kann, ohne dass der Ligand seine Bindungseigenschaften verliert. Für einen zu reinigenden Antikörper kann das z.B. das entsprechende Antigen sein oder für ein Enzym das jeweilige Substrat. Wichtig ist dabei, dass diese Bindung von Antikörper/Antigen oder Enzym/Substrat reversibel ist und durch geeignete Bedingungen bei der Chromatographie das gebunden Protein auch wieder freigesetzt wird. Das wird häufig durch Verwendung eines Puffers mit anderem pH-Wert oder durch den Zusatz von Salzen zum Puffer erreicht.

Tab.1
Typische Liganden für die Affinitätschromatographie
Gewünschtes KomponenteMöglicher Ligand
EnzymSubstrat, Cofaktor oder Inhibitor dieses Proteins
AntikörperAntigen, Virus oder Zelle
LectinPolysaccharid, Glycoprotein oder Zellrezeptor
Hormon, VitaminHormon-Rezeptor, Transportprotein für Hormon oder Vitamin
NucleinsäureNucleinsäure mit komplementärer Basensequenz, Histon, Polymerase oder DNA-bindendes Protein

Idealerweise sollte der Ligand eine Affinität von 10-4 bis 10-8 M für die gewünschte Komponente in freier Lösung haben. Ist die Affinität zu niedrig, bindet die Komponente während der Chromatographie nicht fest genug an den Liganden am Säulenmaterial. Wenn die Affinität des Liganden zu hoch ist, lässt sich die gewünschte Komponente oft nicht mehr ohne Beeinträchtigung seiner Aktivität vom Liganden lösen. Ein Problem stellt manchmal auch die Kopplung des Liganden an das Säulenmaterial selbst dar: Für die kovalente Kopplung sollte immer eine funktionelle Gruppe benutzt werden, die mit der geringsten Wahrscheinlichkeit auch für die Interaktion mit der zu isolierenden Komponente notwendig ist. Mitunter kommt es auch zu sterischen Problemen. Wenn z.B. ein kleiner Ligand wie ein Cofaktor direkt an das Säulenmaterial gebunden wird und die Bindungsstelle für dieses kleine Molekül sehr tief im Protein liegt, ist eine Interaktion der beiden unmöglich. In diesem Fall werden so genannte Spacer-Arme eingesetzt, die den Abstand zwischen Säulenmaterial und Ligand vergrößern. Die richtige Länge des Spacer-Arms ist sehr wichtig: ist der Arm zu kurz, ist er ineffektiv und es kommt noch immer zu keiner Interaktion zwischen Ligand und Protein. Ist er zu lang, kommt es oft zu ungewünschten unspezifischen Interaktion wie hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Spacer-Arm und Protein.

Die Matrix

Als Matrix für Chromatographie von Proteinen wird häufig Sepharose verwendet, ein Agarose-Derivat in Form kleiner Kügelchen mit definierter Porengröße. Dieses Material eignet sich sehr gut für viele Chromatographie-Methoden, da es nur sehr geringe unspezifische Interaktionen mit Proteinen eingeht. Die Hydroxy-Gruppen der Zuckerreste können leicht so modifiziert werden, dass ein spezifischer Ligand kovalent angehängt werden kann.

Ein weiterer Vorteil von Sepharose als Matrix ist die hohe chemische Stabilität des Materials. Sehr hohe oder sehr niedrige pH-Werte beeinträchtigen die Eigenschaften von Sepharose ebenso wenig wie der Zusatz von Detergenzien oder Protein-denaturierenden Chemikalien wie Guanidin-HCl oder Harnstoff. Sepharose kann drucksterilisiert werden (bei 121 °C im Autoklaven) und verträgt viele organische Lösungsmittel. Je nach Anwendung wird unterschiedlich substituierte Sepharose mit unterschiedlicher Porengröße verwendet.

Ein typisches Sepharose-Derivat ist z.B. Bromcyan-aktivierte Sepharose (CnBr-Sepharose), an die sich Liganden mit primären Amino-Gruppen koppeln lassen, oder Thiol-Sepharose, die einen Glutathion-Spacer-Arm besitzt, der Proteine mit freien Thiol-Gruppen bindet.

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