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Chromatographie von Proteinen

Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)

Definition
Hydrophobizität ist eine Eigenschaft, die darauf beruht, dass unpolare Moleküle von einer polaren Umgebung wie z.B. Wasser abgestoßen werden. Wenn ein hydrophobes Molekül in Wasser gegeben wird, entstehen zunächst energetisch ungünstige Bedingungen - das Wasser bildet quasi eine Höhlung um dieses unpolare Molekül. Werden nun weitere unpolare Moleküle hinzugefügt, so aggregieren diese spontan. Das polare Lösungsmittel erzwingt diese Aggregation, es handelt sich nicht um eine Anziehung der hydrophoben Moleküle selbst.

Bei den meisten Proteinen sind die hydrophoben Reste eher im Innern des Proteins, während die hydrophilen Reste auf der Außenseite liegen. Einige Proteine haben aber auch hydrophobe Reste auf ihrer Oberfläche und lassen sich über hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) isolieren. Je hydrophober die Außenseite eines Protein ist, desto leichter adsorbiert es an die hydrophobe Säulenmatrix. Die Bindung hydrophober Proteine an die Säulenmatrix wird durch den Zusatz von Salzen zum Chromatographie-Puffer noch verstärkt. Wenn Salze in wässrigen Puffern gelöst werden, verringert sich die Löslichkeit des Proteins entsprechend und die hydrophoben Interaktionen des Proteins mit dem Säulenmaterial nehmen zu. In der Praxis heißt das, ein Protein wird in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen (1,7 molL-1 (NH4)2SO4, 4 molL-1 KCl oder 4 molL-1 NaCl in gepufferter Lösung) über die HIC-Säule gegeben. Die über hydrophobe Interaktion an die Säule bindenden Proteine werden dann mit einem absteigenden Salzgradienten eluiert. Je weniger hydrophob ein Protein ist, desto eher wird es eluieren.

Die HIC ist im Prinzip der Reversed-Phase-Chromatographie (RPC) sehr ähnlich, bei der ja auch die Interaktion hydrophober Reste mit der Säulenmatrix ausgenutzt wird. Während die HIC in der Regel unter nativen Bedingungen durchgeführt wird, ist bei der RPC die mobile Phase eine Mischung aus Wasser und einem weniger polaren Lösungsmittel, das häufig zur Denaturierung des Proteins führt. Das bedeutet, dass für die HIC lediglich die Oberfläche des Proteins für die hydrophobe Interaktion verantwortlich ist und das Protein seine Integrität behält, während bei der RPC auch die hydrophoben Reste im Innern des Proteins in Kontakt mit der Säulenmatrix treten.

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