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Chromatographie von Proteinen

Die Trennung von Proteinen durch Affinitätschromatographie

Diese Technik macht sich die hohe Affinität vieler Proteine zu bestimmten chemischen Gruppen zunutze. Bei Proteinen sind dies oft Interaktionspartner wie Enzym-Substrat, Antikörper-Antigen, Enzym-Coenzym oder ganz allgemein Protein und Ligand. Zum Beispiel kann das Pflanzenprotein Concanavalin A aufgereinigt werden, indem man einen Rohextrakt auf eine Säule mit kovalent gebundenen Glucoseresten gibt. Concanavalin wird aufgrund seiner hohen Affinität an die Glucose gebunden, während die meisten anderen Proteine im Rohextrakt nicht an Glucose binden und im Durchfluss eluieren.

Ganz allgemein wird bei dieser Methode so vorgegangen, dass ein Substrat oder ein Ligand des gewünschten Proteins kovalent an das Säulenmaterial gebunden wird. Mitunter erfolgt die Bindung des Liganden an die Säulenmatrix über eine Art Arm (Spacer), damit Protein und Liganden effizient interagieren können und keine sterische Behinderung auftritt. Der Rohextrakt wird dann in einem entsprechenden Laufpuffer über die Säule gegeben, wobei das gesuchte Protein gebunden wird, während andere Proteine bei diesem Schritt eluieren. Die selektiv an die Säule gebundenen Proteinmoleküle können dann durch Zugabe eines Überschusses an Substrat oder Ligand oder auch durch Absenken des pH etc. wieder von der Säule eluiert werden.

Diese Art von Chromatographie ist sehr effizient und liefert in den meisten Fällen sehr sauberes Protein. In der rekombinanten DNA-Technologie werden in heterologen Systemen hergestellte Proteine häufig mit Affinitätschromatographie isoliert. Das zu reinigende Protein wird z.B. mit einer Glutathion-Bindungsdomäne fusioniert und das Fusionsprotein über eine Säulenmatrix, an die Glutathion gebunden ist, isoliert. Andere Systeme (andere Affinitätstags) basieren auf Zuckerbindungsdomänen oder kleinen Peptiden wie z.B. der Streptavidin-Tag, der an Streptavidin bindet. Ein Sonderfall der Affinitätschromatographie ist die Metallchelatchromatographie.

Die Immunpräzipitation

Die Immunpräzipitation ist ein typisches Beispiel für eine Affinitätschromatographie, bei der die selektive Bindung eines Antikörpers an ein Antigen ausgenutzt wird.

Abb.1
Immunpräzipitation
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