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Stabilität von Proteinen

Denaturierung durch Oxidation

Extrazelluläre Proteine sind meistens relativ stabil, einfach weil sie quasi natürlicherweise an wechselnde Umgebungen angepasst sein müssen. Im Gegensatz dazu reagieren Proteine aus Zellorganellen in den meisten Fällen erheblich empfindlicher, wenn sie während einer Proteinisolierung einer völlig anderen Umgebung ausgesetzt werden. Diese Proteine sind oft an der Luft nicht stabil.

Tab.1
Im MitochondriumBei der Isolierung im Labor
liegen liegen diese Proteine oft in sehr hoher Konzentration vor (oft mehr als 100 mg/mL.werden die Proteine erheblich verdünnt (oft unter 1 mg/mL).
wird ein stark negatives Reduktionspotenzial durch Reduktionsmittel wie z.B. Glutathion aufrechterhalten.werden Proteine möglicherweise in Puffern mit anderem Reduktionspotenzial isoliert.

Oxidation durch Luftsauerstoff

Proteine mit Cystein-Resten im aktiven Zentrum reagieren sehr sensibel auf die Anwesenheit von Luftsauerstoff. Die Sulfhydryl-Gruppen liegen oft ionisiert vor und oxidieren entsprechend schnell an der Luft. So können sich Disulfid-Brücken, Sulfinsäuren (-S(O)OH) und Sulfonsäuren (-S(O2)OH) bilden oder eine Reaktion mit Metallionen eintreten und das Protein irreversibel inaktivieren. Die Anwesenheit divalenter Ionen beschleunigt diesen Prozess, da diese Ionen Sauerstoff-Moleküle aktivieren können. Die Reaktion mit Sauerstoff wird (teilweise) verhindert durch

  • den Zusatz von 0,1-0,2 mmolL-1 EDTA1), um die zweiwertigen Ionen zu komplexieren
  • den Zusatz eines Reagenz mit Sulfhydryl-Gruppen wie 0,5-1 mmolL-1 Dithiothreitol/Dithioerythritol oder 5-20 mmolL-1 β-Mercaptoethanol zum Aufschluss
Abb.1
Abb.2
1)EDTA: Ethylendiamin-tetraessigsäure
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