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Stabilität von Proteinen

Denaturierung und Renaturierung am Beispiel der Ribonuclease A

Die Ribonuclease A ist ein Enzym, das RNA hydrolysiert. Dieses Enzym besteht aus einem Polypeptidstrang von 124 Aminosäuren und besitzt vier Disulfid-Brücken. Werden diese Disulfid-Brücken mit Perameisensäure in Cysteinsäure-Reste umgewandelt, ist die Ribonuclease irreversibel denaturiert.

In Gegenwart von 8 M Harnstoff und β-Mercaptoethanol wird die Ribonuclease hingegen reversibel denaturiert. Der Harnstoff faltet das Enzym teilweise auf, so dass nun die Disulfid-Brücken durch β-Mercaptoethanol zu Sulfhydrylen reduziert werden. Das Resultat ist ein vollständig gefaltetes Protein (random coil), das keine enzymatische Aktivität mehr besitzt.

Abb.1
Reversible Denaturierung

In Gegenwart von Harnstoff und β-Mercaptoethanol wird die Ribonuclease reversibel denaturiert.

Christian Anfinsen stellte fest, dass diese denaturierte Ribonuclease wieder in die aktive Form überführt werden kann, wenn der Harnstoff und β-Mercaptoethanol durch Dialyse in Gegenwart von Luftsauerstoff entfernt werden. Die Sulfhydryl-Gruppen werden oxidiert und das Enzym faltet sich spontan in die native Konformation zurück.

Abb.2
Renaturierung

Renaturierung der Ribonuclease (Aktivität >90%)

Die natürliche und enzymatisch aktive Form der Ribonuclease entsteht nur unter bestimmten Bedingungen. Ganz anders sieht das Ergebnis der Renaturierung nämlich aus, wenn die Oxidation der Sulfhydryl-Gruppen in Anwesenheit von Harnstoff durchgeführt wird - in diesem Fall erhält man ein Protein, das nur eine minimale oder gar keine Restaktivität aufweist, da es viele Möglichkeiten gibt, um aus acht Cysteinen vier Disulfid-Brücken zu bilden. Wenn man dieser so genannten verschlüsselten Ribonuclease nun β-Mercaptoethanol hinzufügt, wird diese verschlüsselte Form langsam in die aktive Ribonuclease umgesetzt. Die stabile, native Konformation ist die thermodynamisch stabilste Form des Enzyms, und die Abnahme der freien Energie fördert die Umlagerung in die native Form.

Abb.3
Die "verschlüsselte" Form

Übergang von einer verschlüsselten Form (Aktivität 1-2 %) in die native Form

Literatur

Anfinsen, C. B. (1973): Principles that govern the folding of protein chains. In: Science. 181 , 223-230

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