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Bakterielle Einschlusskörper - Inclusion Bodies

Rückfaltung denaturierter Proteine aus Einschlusskörpern

In wenigen Fällen liegen Proteine in Einschlusskörpern teilweise in nativer Konformation vor und lassen sich schon durch Inkubation in geeigneten Chromatographie-Materialien partiell isolieren. Meistens aber bedeutet Solubilisierung von Proteinen aus Einschlusskörpern die vollständige Entfaltung der Tertiärstruktur. Es stellt sich nun die Frage, in welcher Reihenfolge man vorgehen sollte, entweder das Protein zuerst zu reinigen und danach eine Rückfaltung zu versuchen oder eher umgekehrt?

Die Antwort ist schwierig, denn die optimale Methode für die Reindarstellung eines Proteins in seiner nativen Konformation lässt sich nicht ohne Weiteres vorhersagen und sie muss zumeist in vielen Testversuchen ermittelt werden. Wird das Zielprotein in der Wirtszelle nur geringfügig angereichert (2,5 % des Gesamtproteins) führt die Solubilisierung der ganzen Zelle ohne vorherige Isolierung der Einschlusskörper zu einer erheblichen Kontamination mit Wirtszellproteinen. In diesem Fall ist es günstiger, die Einschlusskörper vorher anzureichern. Macht das rekombinante Protein aber >60 % des Gesamt-Zellproteins aus, empfiehlt es sich, die Zellen aufzuschliessen, das Gesamtprotein zunächst zu denaturieren und dann zu renaturieren. Zu guter Letzt wird das rekombinante Protein über Säulenchromatographie oder mit anderen Methoden aufgereinigt.

Proteine, die sich nicht rückfalten lassen

Viele Proteine lassen sich nach einer Denaturierung ohne Aktivtätsverlust in ihre native Konformation zurückfalten. Schwierig wird dieses allerdings, wenn die Proteine in vivo nach der ribosomalen Biosynthese prozessiert werden. Collagen z.B. besteht aus drei Helices, die umeinander gewunden die Collagen-Tripelhelix bilden. Die Helices schließen bündig ab, was in der Zelle dadurch erreicht wird, dass ein lösliches Collagen-Vorläuferpeptid mit globulären Anhängen an den Enden produziert wird, die für einen bündigen Abschluss der Helices sorgen. Dieses Collagen-Vorläuferpeptid wird dann zum reifen Collagen prozessiert, indem die globulären Enden abgespalten werden. Nach einer Denaturierung von Collagen kann dieser bündige Abschluss nicht mehr erreicht werden.

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Abb.1
Collagen-Strang aus drei Ketten

Eine synthetische Collagen-Fibrille aus drei Ketten mit der Sequenz Gly-Pro-Pro (PDB-Code: 1CLG). Prolin-Reste sind gelb, Glycin-Reste in magenta eingefärbt.

Ein weiteres Beispiel für nicht-renaturierbare Proteine ist Insulin. Insulin wird zunächst in einer Vorläuferform (Prä-Proinsulin) synthetisiert. Danach wird die N-terminale Signalsequenz beim Transport in das ER abgespalten und anschließend aus dem Proinsulin durch Herausschneiden des C-Peptids (connecting peptide) das reife, aus zwei Peptidketten bestehende und über zwei Cystine zusammengehaltene, Insulin gebildet.

Abb.2
Das reife Insulin
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