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Strukturanalyse von Proteinen

Röntgenstrukturanalyse

Da die Röntgenstrukturanalyse nur kristalline Strukturen aufklären kann, müssen zunächst unter verschiedenen Bedingungen (z.B. als Funktion der Temperatur, der Salzkonzentration, des pH-Wertes, in Gegenwart von Kokristallisationsmitteln, bestimmten Kofaktoren oder speziellen Liganden ) Proteinkristalle gezüchtet werden.

Protein-Liganden-Komplexe können entweder über die Erzeugung gemischter Kristalle (Ko-Kristallisierung, engl. "co-crystallisation") oder durch Einweichen des Kristalls in einer den Liganden enthaltenen Lösung (engl. "soaking") erhalten werden.

Bei den Kristallformen können von 230 theoretisch möglichen Raumgruppen nur 65 auftreten, weil solche mit Spiegel- oder Inversionssymmetrie wegen der Chiralität von Proteinen von vornherein ausscheiden. Welche der möglichen Kristallisierungsmethoden (wie beispielsweise die Methoden des hängenden oder sitzenden Tropfens oder der Mikrodialyse) zum Erfolg führt, ist für jedes Protein in mühseliger Kleinarbeit auszutesten und erfordert vom Experimentator größtes Geschick sowie Ausdauer. Die wichtigsten Kontrollkriterien im Hinblick auf die Probenbeschaffenheit sind im Folgenden zusammengefasst:

Vor und während der Protein-Kristallisierung durchzuführende Tests auf

  • Reinheit und Homogenität
  • korrekte Faltung
  • Löslichkeit
  • Monodispersität
  • Ligandenbindung
  • funktionelle Aktivität und
  • Stabilität über einen genügend großen Zeitraum (z.B. Tage bis einige Wochen).

Kristallographische Analyse

Die Kristalle werden zur Strukturananalyse mit einem gebündelten Röntgenstrahl beschossen. Dieser kann aus einer konventionellen Röntgenröhre oder aus einer Synchrotronstrahlungsquelle stammen. Synchrotronstrahlung zeichnet sich durch hohe Brillanz, starke Intensität und Polarisierung aus. Sie ist gepulst, d.h. Pulsdauer (ps-Bereich) und -frequenz sind einstellbar. Da die Wellenlängen der Röntgenstrahlen im Ångstrom-Bereich ( 10 10 m) liegen, werden sie an den Elektronen des Proteinkristalls gebeugt bzw. gestreut, wobei ein charakteristisches Diffraktionsmuster entsteht. Die zentralen Gesetzmäßigkeiten der Beugung bzw. Streuung werden durch das von Sir William Henry Bragg und seinem Sohn Sir William Lawrence Bragg aufgestellte Bragg'sche Gesetz erklärt. Applet: Bragg's Law and Diffraction

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Abb.1

Bildung einer Wellenfront am Beugungsgitter. Liegen die Atome so, dass sie gleichzeitig angeregt werden, so ergibt sich eine einheitliche Wellenfront. Werden sie nicht zur gleichen Zeit angeregt, entsteht keine Wellenfront.

Weil Röntgenstrahlen nicht mit einer Linse gebündelt werden können, müssen "mathematische" Linsen verwendet werden, die die Elektronendichteverteilung visualisieren können. Dabei handelt es sich um mathematische Algorithmen, die die Datenflut ordnen und aufschlüsseln. Das Diffraktionsmuster wird auf einem Röntgenfilm registriert und die Elektronendichte-Verteilung über Fourier-Transformationen bestimmt. Daraufhin kann ein 3D-Modell erstellt und verfeinert werden.

Abb.2
Prinzip der Röntgenstrukturanalyse am Beispiel eines konventionellen Diffraktometers
Apparativer Aufbau nach Vorlage von Dr. Hans Briem (ehem. Uni Bremen).

Im Falle einer Proteinstruktur wird die dreidimensionale Anordnung des Moleküls durch einen Vergleich der Elektronendichte mit der Primärstruktur des Proteins erhalten. Die erhaltenen Strukturinformationen hängen stark von der Auflösung ab. Bei einer Auflösung von 4 bis 6 Å kann man meistens nicht mehr als die äußere Gestalt des Proteins und seiner Liganden erkennen. Eine Auflösung von 3,5 Å ermöglicht es, das Peptidrückgrat zu verfolgen. Ab 3,0 Å können auch Seitenketten von Aminosäureresten zugeordnet werden und mit einigen Einschränkungen lässt sich die Elektronendichte mit den Vorgaben aus den Primärstrukturen interpretieren. Die Positionen einzelner Atome können bei einer Auflösung von 2,5 Å mit einer Genauigkeit von ± 0,4 Å und bei 1,9 Å sogar mit ± 0,2 Å bestimmt werden. Es ist mit den üblichen Verfahrensweisen jedoch nicht möglich, die Positionen von Wasserstoff-Atomen zu bestimmen, weil deren Elektronendichte für eine Beugung nicht ausreicht. Ist die genaue Position der Wasserstoff-Atome jedoch von Interesse, kann sie durch Neutronenbeugung am Kristall ermittelt werden. Die Streuung von Neutronen am Wasserstoff-Kern ist auch im Vergleich mit schwereren Kernen noch ausreichend groß. Allerdings ist diese Methode aufwendig und erfordert spezielle apparative Vorrichtungen. Häufig werden Daten aus der Röntgendiffraktion und Neutronenbeugung miteinander kombiniert, um für die Struktur und Funktion eines Proteins wichtige Wasserstoff-Atome zu lokalisieren. Die erhaltenen Daten (Koordinaten, Atomtypen, Bindungsverhältnisse, Sekundärstrukturen etc.) werden in einer Datei abgespeichert, die in öffentlichen Datenbanken zugänglich sind. Die wichtigste Datenbank für Proteinstrukturen ist die Protein Data Bank (PDB), in der die gleichnamigen PDB-Dateien hinterlegt werden.

Abb.3
Typisches Diffraktionsmuster
Abb.4
3D-Karten der Elektronendichte von L-Phe.

Je höher die Auflösung der Diffraktion, desto detaillierter werden die 3D-Modelle.

Beide Vorlagen stammen von Dr. Hans Briem (ehem. Uni Bremen).

Untersuchung dynamischer Strukturänderungen

Die bisherigen Ausführungen bezogen sich alle auf statische Strukturanalysen. Mit Hilfe zeitaufgelöster Kristallographie können auch dynamische Prozesse in Proteinen untersucht werden. Mit Hilfe des so genannten Laue-Verfahrens kann man beispielsweise die licht-induzierten Konformationsänderungen in Pigment-Proteinkomplexen untersuchen. Andere Beispiele sind der Photocyclus des Bacteriorhodopsins und blitzinduzierte Änderungen von Redoxzuständen in Metalloproteinen, wie z. B. der Wasser:Plastochinon:Oxidoreductase (einem zum Photosystem II gehörendem oligomeren Enzym ), welches einen tetrameren Mangan-Cluster enthält. Letzterer ist für den katalytischen Prozess, d.h. die licht-induzierte Sauerstoff-Freisetzung, essenziell. Bei dem genannten Verfahren wird ein Einkristall mit weißem, d.h. polychromatischen, Licht untersucht.

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