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Chemi- und Biolumineszenz

Screening von Substanzbibliotheken mit emittierter Fluoreszenz oder Chemilumineszenz

Fluoreszenzbasierte Methoden zeichnen sich, verglichen mit radioaktiven Methoden, durch eine höhere Sensitivität und weniger gefährliche Handhabung aus. Die wichtigste Methode ist die nach der Zeit aufgelöste Fluoreszenz (time-resolved fluorescence, TRF), die auf den besonderen Eigenschaften der Lanthanide, Europium (Eu), Samarium (Sm), Terbium (Tb) und Dysprosium (Dy) beruht.

Abb.1
Fluoreszenz-basierte Screening-Methoden

Der Energietransfer zwischen dem fluoreszenten Tracer (Donor, Europium-Kryptat und einem Akzeptor, hier: XL665) ist abhängig von der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor innerhalb des Reaktionsmediums sowie der spektralen Übereinstimmung zwischen der Emission des Donors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors. Nach einer Anregung emittiert das Kryptat eine lang anhaltende Fluoreszenz bei 620 nm, während der Akzeptor XL665 ein kurzlebiges Signal bei 665 nm produziert. Kommt es infolge einer engen Nachbarschaft beider Moleküle (wenn also die Testsubstanz zum getesteten Target bioaktiv ist) zu einem Energietransfer, emittiert der Akzeptor XL665 ebenfalls eine lang-anhaltende Fluoreszenz von 665 nm. Das Zeitverhältnis zwischen den beiden Wellenlängen( 665:620) ergibt ein Maß für die Bioaktivität der Testsubstanz.

Sind diese Lanthanide mit einem Liganden cheliert, der in der Lage ist, Anregungslicht zu absorbieren und auf ein Ion zu übertragen, dann wird Fluoreszenz hoher Intensität emittiert. Die Methode zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität, eine große Dynamik sowie die Messbarkeit nach Abklingen jeder Hintergrundaktivität aus. Das produzierte Signal ist stabil und erlaubt damit die weitgehende Automatisierung des Systems. Eine relativ neue Anwendung einer altbewährten Methode für das Wirkstoff-Screening ist die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy, FCS). Mit einer FCS können molekulare Interaktionen in Lösung oder intakten Zellen untersucht werden, indem ein eng gebündelter Laserstrahl eingesetzt wird, um ein Flüssigkeitsvolumen von gerade einmal 10-9 mL zu beleuchten. Moleküle, die aufgrund der Brown'schen Molekularbewegung durch diesen beleuchteten Bereich diffundieren, produzieren einen Aktivitätsausbruch von Lichtquanten, die mit hochsensitiven Einzel-Photon-Detektoren zeitauflösend nachgewiesen werden können. Aus den gemessenen Parametern kann dann die Bindungs- oder Katalyseaktivität einer Testsubstanz abgeschätzt werden.

Ebenso auf der Messung emittierter Fluoreszenz beruhen die verschiedenen Methoden des Calcium-Imagings (fluorimetric imaging plate reader, FIPR), in denen der Anstieg der Ca2+-Konzentration gemessen wird, der für viele Signalkaskaden wie z.B. G-Protein gekoppelte Rezeptoren oder Calcium-Kanäle typisch ist.

Schließlich beruhen auch einige der so genannten Reportergen-Assays auf der Messung emittierten Lichts. Das bekannteste Beispiel sind die Luciferase-Assays, die die im Testsystem erzeugte Chemilumineszenz messen.

Abb.2
Das Prinzip des Luciferase-Testsystems
Abbildung angelehnt an: Böhm, H-J., Klebe, G., und H. Kubinyi (2002): Wirkstoffdesign, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg.

Das Prinzip des Luciferase-Testsystems: Ein Luciferase-Testsystem erfordert zunächst das Einschleusen eines Ko-transfizierten DNA-Strangs im Zellkern. Zunächst wird der Promotor eines Gens, dessen Genprodukt das Target des Screenings darstellt, mit dem Luciferase-Gen gekoppelt. Da der Promotor zunächst aktiviert werden muss, stellt er nun einen selektiven Indikator für Agonisten des natürlichen Aktivators dar. Durch die Koppelung mit dem Luciferase-Gen wird nach der Aktivierung dieses Promotors nun Luciferase hergestellt und dem Testsystem zugegebenes Luciferin unter Chemilumineszenz zu Oxyluciferin umgebaut wird. Will man Antagonisten des Targets testen, so misst man das Verblassen der Chemilumineszenz.

Abbildung angelehnt an Böhm et al., 2002.

Ein weiteres Reportergen-System ist das GFP (green fluorescent protein), das ursprünglich aus der Qualle Aequoria victoria isoliert wurde. Es wird durch drei Eigenschaften zu einem viel versprechenden Vehikel des Wirkstoffscreenings:

  1. Es ist das einzige bekannte Protein, das eine spontane, d.h. nicht durch Enzyme oder Cofaktoren induzierte Fluoreszenz aufweist.
  2. Es ist relativ klein (238 Aminosäuren) und
  3. seine Fluorophore liegen tief in das Zentrum einer β-Barrel-Struktur eingebettet und sind daher wenig abhängig vom umgebenden Milieu.

Literatur

(2002): Wirkstoffdesign, unveränderter Nachdruck der 1. Auflage. H. Böhm Joachim G, Klebe H. Kubinyi (Hrsg.). Spektrum Akademischer Verlag GmbH
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