Screening emittierter Fluoreszenz oder Chemilumineszenz

Abb.1

Energietransfer zwischen dem fluorescenten Tracer (Donor, Europium-Kryptat und einem Akzeptor, hier: XL665) ist abhängig von der Entfernung zwischen Donor und Akzeptor innerhalb des Reaktionsmediums sowie der spektralen Übereinstimmung zwischen der Emission des Donors und dem Absorptionsspektrum des Akzeptors. Nach einer Anregung emittiert das Kryptat eine lang anhaltende Fluoreszenz bei 620 nm während der Akzeptor XL665 ein kurzlebiges Signal bei 665 nm produziert. Kommt es infolge einer engen Nachbarschaft beider Moleküle (wenn also die Testsubstanz zum getesteten Target bioaktiv ist) zu einem Energietransfer, emittiert der Akzeptor XL665 ebenfalls eine lang-anhaltende Fluoreszenz von 665 nm. Das Zeit-Verhältnis zwischen den zwei Wellenlängen 665 und 620 ergibt ein Maß für die Bioaktivität der Testsubstanz.

Sind diese Lanthanide mit einem Liganden cheliert, der in der Lage ist Anregungslicht zu absorbieren und auf ein Ion zu übertragen, wird eine Fluoreszenz hoher Intensität emittiert. Die Methode zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität, eine große Dynamik sowie die Messbarkeit nach Abklingen jeder Hintergrundaktivität aus. Das produzierte Signal ist stabil und erlaubt damit die weitgehende Automatisierung des Systems.

Eine relativ neue Anwendung einer altbewährten Methode für das Wirkstoff-Screening ist die Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (fluorescence correlation spectroscopy, FCS). Mit einer FCS können molekulare Interaktionen in Lösung oder intakten Zellen untersucht werden indem ein eng gebündelter Laserstrahl eingesetzt wird, um ein Flüssigkeitsvolumen von 10^-9 ml zu beleuchten. Moleküle, die aufgrund der Brown'schen Molekularbewegung durch diesen beleuchteten Bereich hindurch diffundieren, produzieren einen Aktivitätsausbruch von Lichtquanten, die mit hochsensitiven Einzel-Photon-Detektoren zeitauflösend nachgewiesen werden können. Aus den gemessenen Parametern kann dann die Bindungs- oder Katalyseaktivität einer Testsubstanz abgeschätzt werden.

Ebenso auf der Messung emittierter Fluoreszenz beruhen die verschiedenen Methoden des Calcium-Imagings (fluorimetric imaging plate reader, FIPR), in denen der Anstieg der Ca²⁺-Konzentration gemessen wird, der für das Ende vieler Signalkaskaden wie z.B. G-Protein gekoppelte Rezeptoren oder Calcium-Kanäle typisch ist.

Schließlich beruhen auch einige der so genannten Reporter-Gen-Assays auf der Messung emittierten Lichts. Das bekannteste Beispiel sind die Luciferase-Assays, die die im Testsystem erzeugte Chemilumineszenz messen.

Abb.2 Abbildung angelehnt an: Böhm, H-J., Klebe, G., und H. Kubinyi (2002): Wirkstoffdesign, Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg.

Das Prinzip des Luciferase-Testsystems: Ein Luciferase-Testsystem erfordert zunächst das Erstellen eines cotransfizierten DNA-Strangs im Zellkern. Zunächst wird der Promoter eines Gens, dessen Genprodukt das Target des Screenings darstellt, mit dem Luciferase-Gen gekoppelt. Da der Promoter zunächst aktiviert werden muss, stellt er nun einen selektiven Indikator für Agonisten des natürlichen Aktivators dar. Durch die Kopplung mit dem Luciferase-Gen wird nach der Aktivierung des Target-Gen-Promotors Luciferase hergestellt, woraufhin dem Testsystem zugegebenes Luciferin unter Chemilumineszenz zu Oxyluciferin umgebaut wird. Will man Antagonisten des Targets testen, so misst man das Verblassen der Chemilumineszenz.

Ein weiteres Reporter-Gen-System ist das GFP (green fluorescent protein), das ursprünglich aus der Qualle Aequoria victoria isoliert wurde. Es eignet sich aufgrund dreier Eigenschaften als Vehikel für das Wirkstoffscreening: