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Viren

Nachweis rekombinanter DNA

Es gibt verschiedene Verfahren, um zu überprüfen, ob der richtige DNA-Abschnitt (Passagier-DNA) in den Vektor eingesetzt wurde und der gewünschte rekombinante Klon entstanden ist. Dabei werden direkte und indirekte Verfahren unterschieden.

Bei den direkten Verfahren wird den Klonen ein gut selektierbarer Phänotyp verliehen, der sie unter bestimmten Wachstumsbedingungen von den falschen Klonen, die keine oder falsche DNA enthalten, unterscheidet.

Bei den indirekten Verfahren wird in den rekombinanten Klonen entweder das Genprodukt, z.B. ein bestimmtes Protein, oder die gewünschte DNA-Sequenz nachgewiesen.

Direkte Methoden

  • Selektion durch Komplementation: Diese Methode kann angewendet werden, wenn vom Wirtsorganismus (z.B. E.coli Stoffwechselmutanten existieren, die auf Grund eines fehlenden Enzyms bestimmte Stoffe nicht mehr selbst synthetisieren können. Mutanten können also nur dann wachsen, wenn dieser Defekt durch die Aufnahme der rekombinanten DNA komplementiert (d.h. ergänzt) wird. In der Praxis trägt die rekombinante DNA das Gen für das fehlende Protein als Marker.
  • Marker-Inaktivierung: Durch Einbringen einer fremden DNA in ein Marker-Gen wie z.B. ein Antibiotikaresistenz-Gen wird dieses Marker-Gen inaktiviert (die Antibiotikaresistenz geht verloren) und ein neuer Phänotyp ausgebildet.

Indirekte Methoden

  • Restriktionsmuster: Charakterisierung von Schnittstellen für Restriktionsenzyme. Die Lage der Schnittstellen lässt sich aus der bekannten Aminosäureabfolge, für die der gesuchte Genabschnitt codieren soll, vorhersagen. Wird in diesem Bereich eine bestimmte DNA inseriert, ändert sich das Restriktionsmuster entsprechend.
  • Hybridisierungsverfahren: Bei allen Hybridisierungsverfahren (Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung etc.) wird die zu analysierende DNA oder RNA über die sequenzspezifische Anlagerung von komplementären, markierten Nucleinsäureabschnitten (den so genannten Sonden) detektiert. Die Markierung kann radioaktiv sein oder durch Anhängen eines Lumineszenz- oder Farbmarkers erfolgen.
  • Nachweis spezifischer Proteine: Um einen bestimmten DNA-Abschnitt aus einem Gemisch rekombinanter DNA-Fragmente nachweisen zu können, wird das Protein detektiert, welches durch diesen DNA-Abschnitt codiert wird. Übliche Verfahren sind die in vitro-Translation, immunologische Tests, Exon-Klonierung oder der Proteinnachweis in Minizellen.
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