| Schritte | Erklärung |
 | | Abb.1 |
| Die Abbildung zeigt einen typischen Ausschnitt aus der Replikationsmaschinerie der Zelle. Man weiß, dass
jeder neue Strang mit einem RNA-Primer beginnt, einerlei ob die Matritze der leading
strand oder der lagging strand war. Dieser Primer muss schließlich entfernt
werden, um eine durchgängige, reine DNA-Struktur zu erhalten. Das Entfernen dieser RNA-Primer und das
Schließen der Lücken ist Teil der so genannten Reparatur, zu der auch die Entfernung von unerwünschten
Modifikationen wie z.B. durch mutagene Substanzen oder UV-Strahlen gehören.
Hier ist nun ein wachsendes Okazaki-Fragment gezeigt. Der RNA-Primer (rot hervorgehoben) beginnt mit
einem Triphosphat als Relikt aus der Synthese. Die Lücke zwischen dem Ende des vorlaufenden
Okazaki-Fragments und dem RNA-Primer ist nicht definiert (undefined gap).
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 | | Abb.2 |
| Sobald das Holoenzym die jetzt doppelsträngige DNA verlassen hat, wird der RNA-Primer (rot hervorgehoben)
mit Hilfe einer DNA-RNA-Hybrid erkennenden Ribonuclease (RNAse, grüner Kreis) vollständig zu
Ribo-Mononucleotiden abgebaut. Es wird schließlich ein 10-20 Nucleotide großer Bereich einsträngiger DNA
gebildet (enlarged gap). Das Ende des vorlaufenden Okazaki-Fragments bleibt von diesem
Abbau unberührt. Bitte achten Sie darauf, dass es sich um das 3'-Ende eines DNA-Stranges handelt. |
 | | Abb.3 |
| Die so geschaffene Situation, nämlich ein durchgehender DNA-Strang stabil gebunden an einen zweiten
DNA-Strang mit freiem 3'-OH-Ende, ist das Substrat für die DNA-Polymerase 1. Sie ist ein typisches
Reparaturenzym, weil sie nur einen Strang synthetisieren kann (vgl. DNA-Polymerase 3). Sie hängt an das
freie 3'-OH so lange 5'-Nucleosidtriphosphate (gap closing) bis sie ermüdet. Sie kann
dabei mit Hilfe ihrer 5'-3'-Exonuklease Aktivität den vorlaufenden Strang abdauen. Auf diese Art wird die
einzelsträngige DNA zum Doppelstrang ergänzt.
Bitte achten Sie darauf, dass vor der Polymerase das 5'-Ende des nachfolgenden Okazaki-Fragments
(schwarz gezeichnet) liegt. Es handelt sich um das 5'-Monophosphat eines Desoxynucleosids, als dem
Produkt des RNAse-Abbaus. (Achtung: Nucleasen produzieren regelmäßig 5'-Monophosphate.)
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 | | Abb.4 |
| Diese Abbildung zeigt nun, in welcher Art die Polymerase-Kettenreaktion die zellulären Komponenten nutzt.
Im Sinne der Komponenten ist allerdings nur noch die DNA als Ausgangsmaterial erhalten geblieben. Sie wird
zuerst durch Denaturierung in Einzelstränge gespalten, so dass sich aufgrund des hohen Primer-Überschusses
ein Primer-DNA-Hybrid bildet (Vorgang hier nicht gezeigt).
Der Gegenstrang ist ersetzt worden durch den grün hervorgehobenen Primer. Der Primer reicht aber trotz
seiner bescheidenen Größe völlig aus, um als Substrat von der Polymerase akzeptiert zu werden. Er
bindet ausreichend stabil an das Template und er bringt ein freies 3'-OH mit (rechtes Feld). Im
linken Feld ist das 5'-Ende des Primers dargestellt. Bitte achten Sie darauf, dass der Primer ein
freies 5'-OH trägt. Für Klonierungszwecke müssen Sie dieses 5'-Ende mit Hilfe einer Kinase
phosphorylieren.
Die DNA-Polymerase 1 ist durch eine hitzestabile Polymerase ersetzt worden. Die Triphosphate (blau)
können für die gezielte Mutagenese und vor allem für die DNA-Sequenzierung modifiziert sein.
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| Tab.1 |
