Die RT-PCR dient zum Nachweis von RNA.
Die RT-PCR dient zum Nachweis von RNA oder einer zur RNA komplementären doppelsträngigen DNA. Mit dieser Methode kann man Untersuchungen von Expressionsmustern auf mRNA-Ebene durchführen. Außerdem kann durch die RT-PCR hoch sensitiv virale RNA nachgewiesen werden. Die RT-PCR ist in zwei Schritte unterteilt:
Im ersten Schritt wird die RNA durch reverse Transkription in cDNA (c steht für komplementäre) umgeschrieben. Dies ist nötig, da viele Polymerasen nicht in der Lage sind, RNA als Template zu verwenden.
Im zweiten Schritt schließt sich eine normale PCR an, in der die im ersten Schritt erzeugte cDNA als Template verwendet wird.
Es gibt auch die Möglichkeit, diese beiden Schritte räumlich und/oder zeitlich voneinander zu trennen. Die herkömmliche Methode ist es, erst reverse Transkriptase in das Reaktionsgemisch zu geben und später dieses als Template in den PCR-Ansatz einzusetzen. Eine andere Methode ist es, Tth-Polymerase (aus Thermus thermophilus) zu verwenden. Die Tth-Polymerase kann sowohl als reverse Transkriptase als auch als Polymerase arbeiten. Die Regulation übernehmen bestimmte Cofaktoren: In Anwesenheit von Mangan-Ionen zeigt die Tth-Polymerase eine reverse Transkriptase-Aktivität, und in Anwesenheit von Magnesium-Ionen eine DNA-Polymerase-Aktivität. So kann man durch Zugabe der richtigen Cofaktoren die gesamte RT-PCR in einem Ansatz durchführen.
