Die hot start-PCR
Bei der hot start-PCR beginnt die Polymerisation erst bei Erreichen einer Mindesttemperatur.
Die hot start- oder auch Heißstart-PCR unterscheidet sich von dem allgemeinen Verfahren nur im ersten Schritt. Die Polymerase-Kettenreaktion wird in diesem Fall erst gestartet, wenn das Reaktionsgemisch die gewünschte Höchsttemperatur erreicht hat. Damit erreicht man, dass die Polymerisation erst beginnt, wenn die Primer spezifisch an die DNA Sequenz gebunden haben. Man erhält weniger Artefakte. Dies kann durch unterschiedliche Verfahren erreicht werden.
Die ursprüngliche Variation war die Zugabe der Polymerase erst nach Erreichen der Schmelztemperatur der DNA. Dieses Verfahren birgt einige Nachteile: da die Polymerase per Hand nacheinander zu vielen Proben pipettiert wird, werden die Reaktionen nicht mehr zeitgleich gestartet. Außerdem kann es durch das Öffnen des Reaktionsgefäßes zu Verunreinigungen kommen.
Eine weitere Methode ist das Trennen der Reaktionskomponenten durch eine Wachsschicht. Dabei werden zuerst die Templates, Puffer, dNTPs, Primer und Zusatzstoffe in das Reaktionsgefäß gegeben. Danach gibt man ein Wachskügelchen definierter Zusammensetzung (im Handel erhältlich) dazu. Beim ersten Erhitzen schmilzt das Wachs und versiegelt die unvollständige Reaktionsmixtur. Darauf gibt man die Polymerase. Schmilzt das Wachs beim Erhitzen und steigt auf, mischen sich die wässrigen Phasen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass alle Reaktionsansätze gleichzeitig gestartet werden. Durch die definierten chemischen Eigenschaften des Wachses, sind die Experimente gut reproduzierbar.
Als Drittes besteht die Möglichkeit des verzögerten Startens der Reaktion durch Verwendung von Antikörpern. In diesem Fall wird eine DNA-Polymerase verwendet, die an Antikörper gebunden ist. Die Antikörper blockieren die Polymerase-Aktivität bei normaler Umgebungstemperatur. Da die Antikörper nicht thermostabil sind, denaturieren und dissoziieren sie beim ersten Erhitzen. Jetzt kann die Polymerase mit ihrer Arbeit beginnen. Dies ist eine spezifische Methode, da die Polymerase erst aktiv ist, wenn die Temperatur so hoch ist, dass die Primer durch die höhere Temperatur spezifisch an die DNA binden.
Die Vorteile der hot start-Methode sind:
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Es reichern sich weniger oder keine Artefakte an.
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Die Polymerase-Reaktion beginnt erst, wenn die DNA vollständig aufgeschmolzen ist.
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Die Polymerisation beginnt erst, wenn die Primer auf Grund der Temperatur spezifisch an die DNA binden.
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Die Primer-Konzentration wird nicht durch eine Dimerisierung der Primer verringert.
