Das Annealing

Unter Annealing versteht man die Anlagerung des Primers an das DNA-Template. Nach dem Aufschmelzen der gesamten DNA wird das Reaktionsgemisch auf eine sehr genau definierte Temperatur abgekühlt. Bei dieser so genannten Annealing-Temperatur kommt es zur spezifischen Bindung des Primers an sein Template. Allerdings auch zur Renaturierung des ursprünglichen Doppelstranges und zur unspezifischen Anlagerung.

Die Renaturierung wird durch den hohen Primer-Überschuss verhindert. Erst nach Bindung der Primer renaturiert der Rest des Templates, ohne den Primer zu verdrängen. Die unspezifische Anlagerung wird dadurch vermieden, dass die Annealing-Temperatur nur ganz schwach (ca. 2 °C) unterhalb der Schmelztemperatur liegt. Naturgemäß ist die spezifische Bindung stabiler. Das nutzt man aus: An ihren stabilen Bindungsstellen binden die Primer gerade noch stabil genug, an den unspezifischen Bindungsstellen kommt es dagegen zu einem fortlaufenden Abschmelzen. In kritischen Fällen kann man auch die Annealing-Temperatur höher als den Schmelzpunkt wählen. Das vermindert die Ausbeute, erhöht aber die Spezifität (vergleiche touchdown-PCR).

An dieser Stelle erkennt man deutlich die wichtige Rolle der Annealing-Temperatur. Weil man die Basenfolge der Primer kennt, kann man stets seine Schmelztemperatur und damit auch die Annealing-Temperatur berechnen. Heutzutage liefern die Hersteller von Oligonucleotid-Primern stets einen Vorschlag für die Schmelztemperatur mit, der sich vor allem an der Purin-Pyrimidin-Verteilung orientiert. In der Praxis reicht die Anwendung der Wallace-Regel aus. Dazu wird die Anzahl der Adenosine und Thymidine bzw. der Guanosine und Cytidine bestimmt. Der AT-Wert wird mit 2, der GC-Wert mit 4 multipliziert. Die Addition ergibt die Schmelztemperatur in °C, die bei typischen Primern zwischen 55 und 65 °C liegt.

Die Schmelztemperatur sollte für beide Primer möglichst gleich sein. Unterscheiden sich die beiden Temperaturen, so muss bei der niedrigeren Temperatur gearbeitet werden. Das führt beim Gegenprimer zur Erhöhung der Unspezifität!

Im Lauf der Reaktion nimmt die Konzentration an Primer stark ab. Um auch in diesem Bereich eine optimale Bindung zu erreichen, kann man die Annealing-Zeit variieren. Liegt das DNA-Template nur in sehr geringer Konzentration vor oder ist das Reaktiongemisch nicht sauber, z.B. durch starke Fremd-Ionen verschmutzt, so kann eine Verlängerung der Annealing-Zeit hilfreich sein, damit der Primer sein Template findet.