Primer sind zumeist DNA-Oligonucleotide (seltener RNA-Oligonucleotide), die als Ausgangspunkt für eine Polymerisation von Nucleinsäuren dienen. Sieht man vom Strangbruch als Einleitung der Reparatursynthese ab, so kommen in der Zelle nur RNA-Primer vor (z.B. Okazaki-Fragmente bei der Replikation oder tRNAs bei reverser Transkription). Im Gegensatz zu RNA-Polymerasen können DNA-Polymerasen nämlich nicht mit einem einzelnen Triphosphat beginnen, sondern benötigen die Hilfe spezieller Primasen oder nutzen bereits vorhandene Oligonucleotide.
Für die Standard-PCR sollten Primer
eine Länge von 18-24 Nucleotiden haben.
keine internen Haarnadelschleifen (hairpin loops) oder anderer Sekundärstrukturen bilden.
keine Homodimere mit sich selbst oder Heterodimere mit dem anderen Primern bilden.
einen ausgeglichenen A/T:G/C-Gehalt aufweisen.
möglichst keine oligo-A oder oligo-G-Abschnitte haben, d.h. über eine gleichmäßige Verteilung der Purine und Pyrimidine verfügen.
annähernd gleiche Schmelztemperaturen (Tm) im Bereich von 55-65
Generell hybridisieren die Primer mit den komplementären Sequenzen des Templates und liefern der Polymerase ein freies 3'-OH für den Beginn der Polymerisation. Dabei ist es extrem wichtig, dass die letzten drei oder besser vier Nucleotide genau passen und besonders stabil sind. Aufgund der höheren Stabilität (3 vs. 2 H-Brücken!) sollte der Primer mit zwei oder besser sogar noch drei GC-Basenpaare enden. Passt das letzte Nucleotide nicht, ist der Misserfolg garantiert.
Die Schmelztemperatur (Tm) kann für jeden Primer mit Hilfe einer einfachen Formel berechnet und so die ideale Annealing-Temperatur bestimmt werden (s. Hybridisierungstemperatur). Aber auch die Primer-Konzentration muss richtig gewählt werden - wird nämlich der Primer in zu geringer Konzentration eingesetzt, gibt es nur wenig oder gar kein Reaktionsprodukt, während bei einer zu hohen Primer-Konzentration Fehlpriming und dadurch zur Akkumulation von unspezifischen Produkten kommen kann. In der Praxis haben sich Primerkonzentration zwischen 0,1 und 1,0 µM als besonders gut geeignet erwiesen.
