Die Polymerase

Die wohl wichtigste Komponente einer erfolgreichen Polymerase-Kettenreaktion ist die DNA-Polymerase I. Alle DNA-Polymerasen katalysieren entsprechend den Watson-Crick-Regeln für die Basenpaarung die Bildung langer Polynucleotid-Ketten aus den einzelnen energiereichen Desoxynucleosidtriphosphaten. Dabei benutzen sie einen der Elternstränge als Vorlage für die Synthese des Tochterstrangs, der damit automatisch komplementär zum Elternstrang hergestellt wird. Die Synthese verläuft streng gerichtet, weil die Polymerisation stets vom 5'-Triphosphat des ersten Nucleotids in Richtung des ständig wandernden 3'-OH-Endes abläuft.

Die eigentliche Aufgabe der DNA-Polymerase I ist die Reparatur von Fehlern bzw. Schädigungen der DNA. Sie benötigt daher für die Polymerisation einen intakten Elternstrang und ein freies 3'-OH des Gegenstrangs. Wie in der Abbildung dargestellt, bilden Strang und Gegenstrang bis zur Anfangsposition der Reparatursynthese einen perfekten Doppelstrang. In der PCR übernimmt der Primer mit seinem freien 3'-OH-Ende die Funktion des Gegenstrangs.

Abb.1DNA-Syntheseschema In der Zelle wird neben einer Fehlbasenpaarung ein Einzelstrangbruch gesetzt, an den die DNA-Polymerase I die korrekten Nucleosidtriphosphate ankondensieren kann. Dieses geschieht unter Abschälung des alten Stranges bis zu einem nicht genau definierten Übergangspunkt.

Als Mullis die PCR entwickelte, benutzte er das so genannte Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli. Dieser Teil der DNA-Polymerase besitzt zwar die Polymerase- und die 3',5'-Exonuclease-Aktivität, aber die 5',3'-Exonuclease-Aktivität fehlt. Das brachte zwar den Vorteil der Unterdrückung der Rückreaktion, aber auch den Nachteil, dass das Enzym bei jeder Hitzedenaturierung der DNA inaktiviert wurde. Vor jeder Verlängerungsphase musste also erneut Polymerase zugegeben werden.

Weitere Informationen zur DNA-Polymerase und dem Klenow-Fragment

Der Siegeszug der PCR wurde erst durch den Hinweis eines Kollegen von Mullis möglich. H. Ehrlich ist zwar für seinen Hinweis, eine temperaturbeständige Polymerase zu verwenden, nicht so berühmt geworden wie der Nobelpreisträger Mullis, dafür aber durch das entsprechende Patent um ein Vielfaches reicher. Heute gibt es zahlreiche verschiedene DNA-Polymerasen im Angebot vieler Firmen. Sie sind alle ursprünglich aus thermophilen Bakterien isoliert und zumeist für die Herstellung in E. coli kloniert. Allen gemeinsam ist ein Temperaturoptimum zwischen 70 und 80 °C. Zum Teil sind sie durch gezielte Veränderungen optimiert. Einige Enzyme verfügen über eine 3',5'-Exonuclease-Aktivität und ermöglichen damit eine Art interner Qualitätskontrolle, die die Rate falsch eingebauter Nucleotide reduziert (proof-reading-Aktvität). Sie katalysieren den Einbau von 35-100 Nucleotiden pro Sekunde, d.h. in einem typischen PCR-Zyklus bis zu 6.000 Nucleotide pro Minute.

Die bekannteste Polymerase stammt aus Thermus aquaticus und wird unter dem Namen Taq-Polymerase oder als Variante Amplitaq vertrieben. Während aber die Taq-Polymerase Synthesen von mehr als 6.000 Nucleotiden kaum zulässt, gibt es Enzyme im Handel, die Produkte mit mehr als 40.000 Nucleotiden zulassen. Die Thermus aquaticus-Polymerase besitzt auch keine Korrekturfunktion und produziert daher mehr Fehler, während z.B. die Pfu-Polymerase aus Pyrococcus furiosus diese Korrekturfunktion hat.