In der PCR werden Nucleotide als Desoxynucleotid-triphosphate (dNTPs) eingesetzt. Obwohl man bei der Wahl der dNTPs nur wenig Spielraum hat, liegt hier dennoch eine der wesentlichen Ursachen für das Misslingen einer PCR. Bei niedrigen Nucleotid-Konzentrationen arbeitet die Polymerase gewöhnlich genauer als bei höheren Konzentrationen, zu geringe Konzentrationen führen zu aber andererseits zu Ausbeuteverlusten. Folgende Grundregeln haben sich in der Praxis bewährt:
Die Triphosphate sollten möglichst frisch sein. Bereits nach einem halben Jahr Lagerung machen sich Disproportionierungsprodukte als Inhibitoren bemerkbar.
Die vier Nucleotide sollten in etwa in äquimolaren Mengen vorliegen.
Die in der Literatur angegebenen Konzentrationen schwanken erheblich und nennen optimale Nucleotid-Konzentrationen von 3-500 µM. Als guter Ausgangswert ist 200 µM anzusehen, aber hier muss jeder neue PCR-Ansatz auch neu optimiert weden.
Die dNTP-Konzentration beeinflusst die Konzentration des freien Magnesiums; bei hohen dNTP-Konzentrationen muss auch ausreichend Magnesium zu Verfügung stehen.
Die Verwendung modifizierter dNTPs ist eine elegante Methode, modifizierte DNA für sehr unterschiedliche Andwendungen herzustellen. Die Polymerasen akzeptieren Modifikationen der dNTPs in quasi allen Positionen, die nicht in die Spezifität der Watson-Crick-Basenpaarung eingreifen. In der Tabelle sind einige Beispiele aufgeführt.
| Nucleotid | Anwendung | Funktion | |||
| Didesoxy-(dd)NTPs | Didesoxysequenzierung von DNA | totaler Kettenabbruch, da kein freies 3'-OH mehr vorhanden ist. | |||
| basenmodifizierte dNTPs (7-deaza-dGTP, dITP) | (automatische) DNA-Sequenzierung | die Unterdrückung von Sekundärstrukturen erziehlt bessere Leseweiten. | |||
| Fluoreszenz-markierte dNTPs | automatische DNA-Sequenzierung | Kettenabbruch mit Markierung, die durch ihre Fluoreszenz detektiert werden kann. | |||
| radioaktiv markierte dNTPs | Herstellung eines markierten Amplikons | kann in weiteren Versuchen mit Countern oder Röntgenfilmen detektiert werden | |||
| biotinylierte dNTPs | nichtradioaktive Markierung | das Amplikon ist später mittels Immobilisierung durch Avidin-Biotin-Wechselwirkungen aufzureinigen | |||
| Tab.1Beispiele für die Verwendung unterschiedlich modifizierter dNTPs | |||||
