Einführung in die PCR
Seit der Entwicklung dieses Verfahrens durch Kary B. Mullis (1983) hat die Polymerase-Kettenreaktion, auch polymerase chain reaction oder PCR genannt, die Biochemie revolutioniert. Erstmals war es möglich, genetisches Material im großen Maßstab in vitro zu vervielfältigen, selbst wenn nur wenige Kopien der DNA zur Verfügung stehen. Die PCR wird heute z.B. eingesetzt, um Mutationen im Erbgut zu bestimmten, Vaterschaftsanalysen oder genetische Fingerabdrücke durchzuführen, Krankheitserreger nachzuweisen und zu typisieren oder ganze Genome zu sequenzieren.
Die Methode beruht auf der Fähigkeit der DNA-Polymerasen, DNA ausgehend von einem Primer identisch zu kopieren und so lange zu verdoppeln, bis die Reaktion erschöpft ist. Die folgende Animation zeigt stark vereinfacht den Ablauf der Reaktion (klicken Sie auf das Bild, um die Animation zu starten).
Die für eine PCR benötigten Komponenten sind:
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eine doppelsträngige DNA-Matrize (Template).
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zwei Initiationsstellen in Form kurzer Oligonucleotide, den Primern.
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eine temperaturstabile DNA-Polymerase zur Katalyse der DNA-Synthese.
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die vier Desoxynucleosid-triphosphate dATP, dCTP, dGTP, dTTP als Substrate für die DNA-Polymerase.
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Magnesium-Ionen und bestimmte Zusatzstoffe, die von den Herstellern der Polymerasen aus patentrechtlichen Gründen zumeist nicht genau angegeben werden.
Nach dem vollständigen Schmelzen des Templates zu Einzelstrang-DNAs hybridisieren die Primer an komplementäre DNA-Sequenzen, die das Template auf je einem Strang flankieren, und begrenzen so durch Ausbildung eines stabilen DNA-Doppelstranges den zu amplifizierenden Bereich. Die DNA-Polymerase verlängert die Primer so lange, bis die Reaktion abgebrochen wird (Verlängerungsprodukte) oder bis sie an das Ende des Templates kommt (Endprodukte). Durch eine Temperaturerhöhung werden Template und Syntheseprodukt nun wieder voneinander getrennt; ein neuer Zyklus kann beginnen.
Verwendet man in diesem Prozess eine temperaturstabile Polymerase (z.B. die Taq-Polymerase), die nicht während des Schmelzvorgangs denaturiert, wird das Template so lange exponenziell vermehrt, bis die Menge an Primern und/oder Triphosphaten erschöpft ist.
Die Bindung des Primers erfolgt aufgrund seines extrem hohen Überschusses im Vergleich zur Template-DNA (Massenwirkungsgesetz). Ein einmal gebundener Primer kann auch von einem noch so stabilen und langen Gegenstrang nicht verdrängt werden.
