Gensuche mit PCR

Eine häufige Ausgangslage in der Molekularbiologie besteht darin, dass man entweder bereits ein Gen kennt und den entsprechenden Nachbarn charakterisieren will oder dass man zu einer bestimmten Proteinsequenz das Gen sucht. In beiden Fällen ist die PCR heute die Methode der Wahl. Ein besonders wichtiges Problem in der Molekularbiologie ist das Auffinden eines Gens für ein bereits charakterisiertes Protein. Wenn man ausschließlich die Proteinsequenz kennt, kann man nur bei den Aminosäuren Methionin und Tryptophan direkt auf die DNA-Sequenz schließen. In allen anderen Fällen gibt es zwei, drei, vier oder gar sechs verschiedene Codons. Deswegen war man bei der Suche mit Hilfe von Hybridisierungsproben darauf angewiesen, Proteinabschnitte mit möglichst vielen Aminosäuren mit nur ein- oder zweideutigen Codons zu benutzen.

Bei der PCR ist das nun - zumindest theoretisch - völlig anders. Natürlich hat sich der genetische Code nicht geändert. Aber durch die Möglichkeit, in zwei aufeinander aufbauenden Runden dasselbe Fragment zu amplifizieren, erreicht man eine genügende Spezifität, um selbst mit völlig degenerierten Sequenzen das gesuchte Gen zu amplifizieren. Die Vorgehensweise, die unter dem Begriff nested PCR in die Literatur eingegangen ist, ist in Teil A der Abbildung dargestellt. Hat man erst einmal ein genügend großes Fragment der DNA amplifiziert, ist es ein leichtes, via Hybridisierung das vollständige Gen zu finden. Die Verwendung von Inosin scheint eine elegante Methode zu sein, um sich den gesuchten Sequenzen gezielt zu nähern. Allerdings gehört wohl auch häufig genug eine Portion Glück dazu, das richtige Gen mit Hilfe von Inosin zu fischen. Die Suche nach einem benachbartem Gen ist durch Teil C der Abbildung illustriert. Man benutzt die so genannte inverse PCR. Diese Methode ist mit dem primer walking unter Verwendung von Restriktionsfragmenten und sequenzieller Hybridisierung verwandt. Die inverse PCR hat den Vorteil, dass die gesuchten Abschnitte sofort als klonierbares Material vorliegen.

Abb.1 Schema: Gensuche mit PCR

Teil A: Anwendungsbeispiel für extrem degenerierte Primer. Durch die Verwendung von Oligonucleotid-Gemischen kann man unsichere Aminosäure-Positionen abdecken. In einem ersten Schritt werden in diesem Beispiel die Primer R112 mit 12.288 Möglichkeiten und A232 mit 73.728 Möglichkeiten eingesetzt. Setzt man nun das Gemisch aus der ersten PCR in eine zweite PCR ein und verwendet zusätzlich Inosin, um die Zahl der Möglichkeiten zu reduzieren, bekommt man mit ein wenig Glück die gesuchte DNA-Sequenz. Teil B: stellt die in Teil A beschriebene nested PCR noch einmal schematisch dar. Teil C: Ablaufschema für die inverse PCR. Diese Methode wird invers genannt, weil man von einer bekannten Sequenz ausgeht und sie nach einem Ringschluss quasi umstülpt. Dazu werden zwei flankierende Restriktionsschnittstellen desselben Enzyms (hier Ndel) benutzt, die etwa in dem gewünschten Abstand liegen müssen und nicht in dem bereits bekannten Bereich vorkommen dürfen. Umgekehrt wird eine singuläre Restriktionsschnittstelle (hier Xhol) benötigt, die nur in dem bereits bekannten Bereich vorkommt. Durch abwechselndes Schneiden und Ligieren kommen die ausgewählten Primer-Bindungsstellen, die zuerst nach außen zeigten, so zu liegen, dass die Amplifikationen wieder aufeinander zulaufen können. Der dazwischen liegende Bereich wird jetzt synthetisiert und kann durch den im Produkt singulären Ndel-Schnitt wieder getrennt werden. Bei diesem Vorgehen ergeben sich zwar zahlreiche Ligationsprodukte, jedoch wird nur das gewünschte Produkt amplifiziert. Andere Ligationsprodukte mit mehr als einem Ndel-Schnitt werden zwar gebildet, fallen später aber nicht ins Gewicht, weil sie durch Nachschneiden mit Ndel entfernt werden können. Da derartige Fragmente aus einer nicht-definierten Position kommen, dürfen sich nicht als Nachbarfragmente eingeordnet werden.