Erstellen einer cDNA-Bank mit PCR
Die DNA-Kopie einer mRNA wird cDNA genannt (cDNA abgeleitet von copy-DNA). Diese cDNA unterscheidet sich bei Bakterien nur in Ausnahmefällen, bei Eukaryonten aber fast immer deutlich von der chromosomalen DNA. Bei Eukaryonten wird von der chromosomalen DNA zunächst eine vollständige mRNA-Kopie hergestellt. Diese sogenannte prä-mRNA (frühe mRNA) wird in der Zelle häufig ganz erheblich verkürzt. Dieser Vorgang wird Spleißen genannt und führt zum Verlust von mitunter mehr als 90 % der RNA. Außerdem wird an die mRNA ein so genannter polyA-Schwanz angehängt, bevor die reife mRNA den Zellkern verlässt und translatiert wird. Alle diese Veränderungen sind Teil eines komplizierten Regulationsschemas der eukaryontischen Zellen. Zur Funktion der mRNA gehört auch, dass sie sehr leicht abgebaut wird, wenn sie nicht mehr benötigt oder aus dem optimierten Milieu der lebenden Zelle isoliert wird. Da quasi alle eukaryontischen mRNAs einen polyA-Schwanz tragen, lassen sich diese leicht isolieren, indem man Affinitätssäulen mit oligo-dT einsetzt, an die polyA-mRNA bindet. Bruchstücke ohne polyA-Schwanz, die sich aus dem raschen Abbau der mRNA in der Zelle ergeben, lassen sich mit diesem Verfahren allerdings nicht isolieren.
Da es für das Verständnis der zellulären Vorgänge unbedingt notwendig ist, die Sequenz der vollständigen mRNA zu kennen, muss die gesamte, unveränderte mRNA in DNA umgeschrieben und dann als stabile cDNA in Form einer Genbank kloniert werden.
Die PCR hat nun einen besonders eleganten Weg zur Anlage einer vollständigen Genbank eröffnet: Nach der Entfernung von Proteinen und Lipiden wird die gesamte mRNA mit Hilfe eines oligo-dT-Primers in ein relativ stabiles RNA-DNA-Hybrid überführt. Nun wird mit Hilfe eines Enzyms names Terminale Transferase an die freien 3'- Enden der neusynthetisierten DNA und der mRNA (also an den polyA-Schwanz) jeweils ein oligo-dG-Schwanz angehängt. Die mRNA wird nun alkalisch hydrolysiert und die verbleibende einzelsträngige DNA mit Hilfe eines Primers gegen den olido-dG-Schwanz zur doppelsträngigen DNA vervollständigt. Anschließend kann die normale Amplifikation durch einen zweiten Primer komplementär zum jetzt entstandenen oligo-dA-Schwanz stattfinden. Der besondere Trick dieses Schritts liegt nun in der Tatsache, dass die Primer an ihrem 5'-Ende einen Klonierungslinker für je einen technisch sehr günstigen Restriktionsschnitt miteinbringen (vgl. Teil B der Abb.). Mit Hilfe dieser Restriktionsschnittstelle lässt sich schließlich das Amplifikationsprodukt leicht klonieren. Die Genbank steht nun für eine Hybridisierung oder andere Verfahren zur Verfügung.
