Ähnlich wie bei der Vermehrung von doppelsträngiger DNA kann man die PCR auch zur Sequenzierung nach der Sanger-Methode mittels Kettenabbruch-Reagenzien einsetzen. Die Taq-Polymerase akzeptiert fluoreszierende Didesoxynucleotide als Abbruchreagenzien. Liegt die gesuchte DNA nur in sehr geringen Konzentrationen vor, so kann man in einer asymmetrischen Reaktion mit einem zehnfachen Überschuss des einen Primers zuerst die gewünschte DNA als Einzelstrang vermehren, um sie nach Verbrauch des anderen Primers in geringerer Konzentration und nach Zugabe des restlichen anderen Primers und der Kettenabbruch-Reagenzien zur Sequenzleiter aufzubauen. Dieses Gemisch kann wie eine normale Sanger-Sequenzierung gelektrophoretisch aufgetrennt und analysiert werden.
Amplifizierte DNA kann zunächst in größerer Menge hergestellt und aufgereinigt werden. Wenn man jetzt nur noch einen Primer einsetzt, können Leseweiten von über tausend Nucleotiden erreicht werden. Dieser Weg wird für die automatische Sequenzierung kleinerer DNA-Abschnitte besonders erfolgreich eingesetzt. Bei der Sequenzierung ganzer Genome verwendet man die klassische Klonierung, um dann aus so genannten Plasmiden die Sequenzierung mit nur einem Primer durchzuführen.
