Die Mutagenese mit PCR

Teil A der Abbildung zeigt das Prinzip. Einer der beiden Primer enthält eine Mutation, z.B. einen Basenaustausch, eine Deletion oder eine Insertion. Wenn diese Mutation genügend weit vom 3'-OH entfernt ist, akzeptiert die Polymerase diesen Primer.

Zuerst hat man gemäß Teil B nicht nur mit zwei Primern, sondern mit insgesamt vier Primern in drei Schritten gearbeitet: Die zwei Primer 2 und 3 dienen dazu, die Mutation zu setzen. Die zwei Gegenprimer 1 und 4 passen exakt auf die Ausgangs-DNA und haben die Aufgabe, die Mutation in einen stabilen Bereich unmodifizierter DNA einzubinden und den entsprechenden DNA-Abschnitt anzureichern. Man muss die Produkte isolieren und dabei die überschüssigen Primer entfernen, oder man führt die Reaktion soweit, dass alle Primer verlängert sind. Gemäß Abbildung B werden die Produkte gemischt und mit den direkt passenden Primern 1 und 4 amplifiziert. Die Primer mit der gewünschten Mutation müssen länger gewählt werden, so dass jede flankierende Sequenz für sich allein eine stabile Doppelhelix bilden kann. Im konkreten Fall reichen zumeist anstelle von 2x20 Basenpaaren 2x12 Basenpaare.

Wenn man einen Zwischenisolierungsschritt einfügt, kann die ganze Prozedur mit nur drei Primern und mit einem Amplifikationsschritt weniger durchgeführt werden (vgl. Teil C). Ein besonders eleganter Weg ist die Mutagenese mit nur zwei Primern. Man verfährt wie bei der Herstellung von Fusionsproteinen mittels inverser PCR. Allerdings sind hier viele Fehlerquellen vorhanden, so dass zumeist mit der 3-Primer-Methode gearbeitet wird. Anschließend gelingt durch Umsetzen des gesamten DNA-Abschnittes die ewünschte Mutation mit maximaler Ausbeute. Allerdings sei bei der PCR-Vermehrung angemerkt, dass die Fehlerrate der Taq-Polymerasen offensichtlich höher ist als die der E.coli-Polymerase. Man kann heute eine thermophile Polymerase mit proofreading-Aktivität (z.B. die Vent-Polymerase von Biolabs) verwenden, sollte aber trotzdem in jedem Fall den umgesetzten Bereich durch DNA-Sequenzierung überprüfen.

Schema der Mutagenese Abb.1 Abb.2 Abb.3 Teil A: Bauprinzip der verschiedenen Primer für Punktmutationen, Deletionen und Insertionen. Die Größe der Deletion bzw. der Insertion ist hier willkürlich gewählt. Teil B: Gerichtete Mutagenese in drei Schritten mit Hilfe von vier Primern. Zuerst werden parallel zwei Amplifikationen einmal proximal und einmal distal zur gewünschten Mutationsposition durchgeführt. Primer 2 und 3 enthalten die gewünschte DNA-Sequenz. Die beiden Produkte werden isoliert und gemischt und unter Zugabe der der flankierenden Ursprungssequenz komplementären Primer 1 und 4 in die dritte Amplifikation eingesetzt. Nach erfolgreicher Klonierung dieses Produktes ist eine DNA-Sequenzierung unabdingbar, weil nur so Amplifikationsfehler erkannt werden können. Teil C: Gerichtete Mutagenese in zwei Schritten mit Hilfe von drei Primern. In einem ersten Schritt wird die gewünschte Mutation so gesetzt, dass sie im zweiten Schritt in einer Verlängerung des Primers 1 resultiert. Das Produkt wird isoliert und zusammen mit dem vollständig komplementären Primer 3 in eine zweite Amplifikationsrunde eingesetzt. Der verlängerte Primer 2 hat nun keinen Gegenprimer und ist demzufolge inaktiv, während der verlängerte Primer 1 zum gewünschten, mutierten Hauptprodukt führt. Punktmutationen, Deletionen und Insertionen können hergestellt werden. Für Vorsichtsmaßnahmen vergleiche Teil B.