Fusionsproteine

Die Aufreinigung von Proteinen nach der gentechnischen Expression ist häufig nicht trivial. Man bedient sich deshalb eines Tricks, indem man zuerst ein Fusionsprotein exprimiert, das dann entweder direkt aus der Zelle geschleust oder über Affinitätschromatographie gereinigt wird. Die Fusion muss allerdings punktgenau erfolgen, um den Fremdanteil des Fusionsproteins später wieder entfernen zu können.

Vor der Einführung der PCR konnte man nur durch eine besonders aufwendige Totalsynthese oder mittels zufällig in dem entsprechenden Gen vorhandener Restriktionsschnitte Fusionen bewerkstelligen. Jetzt kann man mit Hilfe der PCR jedes beliebige Fusionsprotein herstellen. Eine ältere Methode entspricht der ursprünglichen Mutationsstrategie und benötigt insgesamt drei PCR-Amplifikationsschritte. Dabei wird an den exakt passenden Bereich des Primers am 5'-Ende eine Sequenz angefügt, die zu dem Bereich komplementär ist, der fusioniert werden soll (A). Das Verfahren versagt bei zwei nahe verwandten Genen. Wenn man allerdings die zwei gewünschten DNA-Abschnitte zusammen mit dem gesamten Vektor amplifiziert, gelingt die Amplifikation nicht nur ohne Beschränkung, sondern sogar in nur einem Schritt. Das Schema der nach außen gerichteten Amplifikation ist in Teil B der Abbildung dargestellt. Bei Verwendung der richtigen Polymerase werden leicht mehr als 10.000 bp amplifiziert. Für eine erfolgreiche Reaktion ist es allerdings unbedingt erforderlich, dass die 5'-Enden der Primer als vorgewählte Fusionsstellen während der gesamten Reaktion erhalten bleiben. Weder sie selbst noch die neusynthetisierten Gegenstränge dürfen abgebaut oder verlängert werden. Deshalb darf diese Anwendung nicht mit der Taq-Polymerase durchgeführt werden (Achtung: Addition eines Adenosins !). Nur dann gelingt eine optimale blunt end-Ligation. Das gesamte amplifizierte Plasmid wird in die Bakterienzelle gebracht und vermehrt.

Als Beispiel sei die Verwendung des Hexa-Histidin-Restes genannt, der auch in Teil B der Abb. dargestellt ist. Hier gelingt eine Aufreinigung mittels einer Nickel-Affinitätssäule.

Abb.1Herstellung von Fusionsproteinen in drei Schritten (A) und Einschritt-Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen mittels PCR (B) (A) : Diese Methode ist direkt von der Herstellung von Punktmutanten abgeleitet. Die Besonderheit besteht darin, dass die Primer 1 und 4 jeweils an ihrem 5'-Ende eine Verlängerung besitzen, die zur Ursprungs-DNA nicht mehr komplementär ist. Die Enden sind aber untereinander komplementär und lassen sich nach den beiden parallelen Amplifikationen 1 und 2 in einer dritten Runde ohne den Zusatz weiterer Primer direkt zum gewünschten Fusionsprotein amplifizieren. (B) : Durch eine nach außen gerichtete Amplifikation über den Replikationsursprung (origin of replication) gelingt eine punktgenaue Deletion beliebiger Sequenzen. Dieses Verfahren ist sehr schnell und vermeidet die Einführung von Fremdsequenzen. Trägt ein Primer eine Mutation, kann ohne Deletion über das so genannte 2-Primer-Verfahren die Mutation direkt gesetzt werden. Wenn man das Ausgangsmaterial mit DAM-Methylierung mit Hilfe des Restriktionsenzyms DpnI verdaut, gelingt eine selektive Entfernung des Ausgangsmaterials.