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Oligonucleotid-Synthese

Das Phosphotriester-Verfahren

Abb.1
Reaktionsschritte des Phosphotriester-Verfahrens

R1, R2: Base; DMTr: Dimethoxytrityl; MSNT: 1-Mesitylensulphonyl-3-nitro-1,2,4-triazol; S: Festphase

Das Phosphotriester-Verfahren wurde von R. Letsinger entwickelt, um die Nachteile der Diester-Methode zu umgehen, und dann von K. Itakura und M. Gait perfektioniert. Mit dieser Methode lassen sich Oligonucleotide mit einer Länge von 20-30 problemlos in ausreichender Qualität und Quantität darstellen. Bei dieser Methode handelt sich um eine Festphasen-Methode im Sinne der Merryfield-Synthese von Oligopeptiden. Als Träger wird aktiviertes Glas mit definierten Poren verwendet. Die Effizienz dieses Verfahrens liegt bei 90-95 %. Am Anfang der Synthese steht ein 3'-terminales Nucleosid, welches über einen Spacer mit einem Trägermaterial wie Glas verbunden ist. Durch den Einbau von Monomer-Bausteinen erfolgt eine schrittweise Verlängerung der Oligonucleotidkette, die zum 5'- Ende hin wächst. Die Dimethoxytrityl-Gruppe (DMTr) dient als Schutzgruppe für die 5'-OH-Gruppe der Phosphoramidite und der Phosphor trägt am 3'-OH eine β-Cyanoethyl- und eine N,N-Diisopropylamino-Gruppe. Während die exocyclische Amino-Funktion des Adenins bzw. des Cytosins mit einer Benzoyl-Gruppe geschützt wird, erfolgt der Schutz der exocyclischen Amino-Funktion des Guanins mit einer Isobutyl-Gruppe. Die Basenschutz-Gruppen werden erst nach beendeter Synthese abgespalten, während die Schutzgruppen am 5'-Ende für jede Kopplung entfernt werden müssen.

Die Schritte im Einzelnen

  1. Der Zyklus beginnt mit der Entfernung der DMTr-Schutzgruppe am 5'-Ende der Oligonucleotidkette durch eine Dichloressigsäure-Lösung oder mit Zinkbromid. Dieser Schritt wird auch als Detritylierung bezeichnet.
  2. Es folgt die Addition des geschützten Phosphoramidit-Bausteins, dessen Aktivierung und Kopplung mit der freigewordenen 5'-OH-Gruppe des an den Träger gebundenen wachsenden Oligonucleotids. Als Aktivierungsagens dient Tetrazol, welches durch die Protonierung der Amino-Gruppe des Phosphoramidits den Abgang des Diisopropylamins bei dem nucleophilen Angriff des Phosphors auf die 5'-OH-Gruppe erleichtert. Da diese Reaktion unbedingt wasserfrei ablaufen muss, wird als Lösungsmittel trockenes Acetonitril verwendet und das System unter Schutzgas (Argon oder Helium) gestellt.
  3. Alle bei der Kopplung nicht umgesetzten 5'-OH-Enden werden beim capping mit Acetanhydrid / N-Methylimidazol blockiert, um Fehlsequenzen zu verhindern.

Da das Dimethoxytrityl-Kation eine intensive orangene Färbung aufweist und daher photometrisch bestimmt werden kann, ist es möglich die Kopplungsausbeute zu bestimmen. Diese Messung kann entweder online unter Verwendung eines Tritylmonitors oder offline durch das Zurückbehalten der durch den DNA-Synthesizer gepumpten Lösungen mit einem Fraktionssammler und anschließender photometrischen Absorptionsmessung vorgenommen werden. Nach einem erneuten Durchlauf des Zyklus, welcher die Zugabe, Aktivierung und Kopplung eines Phosphoramidits beinhaltet, erfolgt die Verlängerung der Oligonucleotidkette um einen weiteren Baustein. Das Oligonucleotid wird nach Abschluss der Synthese durch Ammoniumhydroxid vom Träger abgespalten. Außerdem werden die Basenschutzgruppen und die β-Cyanoethyl-Gruppen am Phosphor entfernt.

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