zum Directory-modus

Oligonucleotid-Synthese

Das Phosphodiester-Verfahren

Abb.1
Reaktionsschritte des Phosphodiester-Verfahrens

Das Phosphodiester-Verfahren wurde von Khorana und seinen Kollegen entwickelt und hatte zwei wesentliche Nachteile: es wurde in Lösung gearbeitet, so dass die sich daraus ergebenden Ausfällungs- und Waschschritte diese Methode aufwendig, teuer und wenig effizient im Bezug auf die Ausbeute machten. Zudem werden bei diesem Verfahren Kondensationsreaktionen mit geladenen Molekülen vorgenommen. Daraus entstehen polare Reaktionsprodukte, die das Arbeiten in unpolaren Lösungsmitteln verhindern - der Reaktionsverlauf ist allerdings nur in unpolaren Lösungsmitteln optimal.

Abb.2
N2-Isobutyrylguanin
Abb.3
Thymin
Abb.4
N4-Anisoylcytosin
Abb.5
N6-Benzoyladenin

Im Unterschied zur Phosphotriester-Methode, die mit drei Schutzgruppen arbeitet, werden beim Phosphodiester-Verfahren nur zwei Schutzgruppen verwendet. Bei beiden Verfahren wird nach der Synthese die MMTr1)-Schutzgruppe (Abb. 6) durch Detritylierung entfernt. Bei der Phosphodiester-Methode liefert diese Detrylierung ein biologisch aktives Oligonucleotid. Anstelle von TiPBSCl2) (Abb. 7) kann auch DCC3) (Abb. 8) verwendet werden, denn beide Substanzen aktivieren die 5'-Phosphat-Gruppe für die Kondensation.

Abb.6
Mono-p-methoxy-tritylchlorid (MMTrCl)
Abb.7
2,4,6-Tri-iso-propyl-benzol-sulfonylchlorid (TiPBSCl)
Abb.8
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC)

Für die nachfolgende Behandlung ist es von Vorteil, wenn die MMTr-Gruppe noch nicht nach dem letzten Cyclus abgespalten wird, denn die unpolare MMTr-Gruppe erleichtert die Aufreinigung des Oligonucleotids über reversed phase (RP)-HPLC-Säulen: Fehlsequenzen weisen keine MMTr-Gruppe auf und lassen sich als polarere Fraktion leichter abtrennen. Bei der HPLC werden Oligonucleotide an einer stationären Phase aufgrund ihrer Größe, Ladung und polaren Eigenschaften getrennt.

Die Abspaltung der MMTr-Gruppe erfolgt nach dem HPLC-Lauf durch eine Behandlung mit Dichloressigsäure. Falls eine weitere Aufreinigung des Oligonucleotids nötig ist, wird eine HPLC auf RP- oder Anionenaustausch-Materialien bzw. eine präparative Elektrophorese in Harnstoff-Gelen durchgeführt. Diese Gele werden zur Detektion auf eine Dünnschichtplatte mit UV-Indikator-Farbstoff gelegt und mit UV-Licht beleuchtet. Da die Oligonucleotide das UV-Licht absorbieren wird ihr "Schatten" auf der Dünnschichtplatte sichtbar (shadow-casting-Gel).

1)MMTr: Monomethoxytrityl
2)TiPBSCl: Tri-iso-propyl-benzol-sulfonylchlorid
3)DCC: Dicyclohexylcarbodiimid
Seite 3 von 7