zum Directory-modus

Oligonucleotid-Synthese

Die Reaktionsschritte des Phosphittriester-Verfahrens

Zur Oligonucleotid-Synthese wird oft die β-Cyanoethyl-phosphoramidit-Variante des Phosphittriester-Verfahrens angewendet. Dabei handelt es sich, wie bei dem Phosphotriester-Verfahren, um eine Festphasen-Methode. Das bedeutet, dass das erste Nucleotid-Monomer mit seinem 3'-Ende an einer festen Phase (Aminopropyl-Glas, Polydimethylacrylamid-Kieselguhr, aktives Silicagel) gebunden ist.

Aufgrund der entstehenden hochreaktiven Tetrazolide sind die Reaktionszeiten der einzelnen Reaktionsschritte kürzer als bei der Triester-Methode. Sofern die einzelnen Reaktionsschritte mit einer Effizienz von 99 % ablaufen, lassen sich Oligonucleotide mit einer Kettenlänge von 200 synthetisieren.

Das heute am häufigsten verwendete Phosphit-Verfahren kann wegen der Strategie der eingefügten Schutzgruppen als Triester-Methode bezeichnet werden, obwohl während der Synthese Phosphit-Zwischenprodukte (Verbindungen des dreiwertigen Phosphors) und nicht Phosphat-Zwischenprodukte (Verbindungen des fünfwertigen Phosphors) wie bei der ursprünglichen Triester-Methode entstehen.

Vorbereitung: Vollständige Reaktion der Nucleosid-Phosphorylierung

Die Synthese von Oligonucleotiden (am Beispiel einer Methoxyphosphan-Variante) lässt sich in vier Teilschritte gliedern:

1. Detritylierung Durch eine Säurebehandlung, z.B. mit Di- oder Trichloressigsäure, wird die Dimethoxytrityl (DMTr)-Schutzgruppe am 5'-Ende der wachsenden Oligonucleotidketten entfernt. Die Ketten sind beim Phosphotriester- und beim Phosphittriester-Verfahren an ihren 3'-Enden mit der Festphase verankert.

Vollständige Reaktion der Detritylierung in Formeln

2. Kopplung Ein 3'-Phosphoramidit-Derivat eines Desoxyribonucleosids, das an die nächste Position der Oligonucleotidkette anschließen soll, wird an das freigewordene 5'-Ende des Oligonucleotids gekoppelt. Bei diesem Reaktionsschritt dient Tetrazol als Kopplungsagens.

Vollständige Reaktion der Kopplung in Formeln

3. Oxidation Bei der Kopplungsreaktion ist ein Phosphittriester entstanden, der in diesem Reaktionsschritt zum Phosphotriester oxidiert wird. Dadurch wird die Oligonucleotidkette um ein Nucleotid verlängert.

Vollständige Reaktion der Oxidation in Formeln

Beim Phosphotriester-Verfahren entfällt der Oxidationsschritt, da der Phosphor schon in seiner höchsten Oxidationsstufe vorliegt.

4. Das capping Beim capping werden alle 5'-Enden, die in der Kopplungsreaktion nicht reagiert haben, durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid (AcOAc) inaktiviert. Die acetylierten Oligonucleotide werden dadurch von nachfolgenden Kopplungsreaktionen ausgeschlossen. Damit wird die Verlängerung von falschen bzw. nicht erwünschten Oligonucleotiden verhindert.

Vollständige Reaktion des cappings in Formeln

Seite 5 von 7