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Oligonucleotid-Synthese

Einführung

In den 60-igerer Jahren entwickelten H. Gobind Khorana und seine Mitarbeiter die erste anwendbare DNA-Synthesetechnik. Diese Methode war allerdings sehr arbeitsaufwändig, da alle Reaktionen in Lösung stattfanden und die Produkte auf jeder Stufe der Synthese isoliert werden mussten. Dennoch konnte Khorana mit dieser Methode (in Kombination mit enzymatischen Techniken) erstmalig ein tRNA-Gen mit 126 Nucleotiden synthetisieren.

In den frühen 80-iger Jahren wurde das von Khorana entwickelte zeitaufwändige Verfahren durch schnellere Festphasen-Methoden ersetzt, die eine Automatisierung der Oligonucleotid-Synthese erlaubten. Heute wird vor allem die Phosphoramidit-Methode zur Herstellung von Oligonucleotiden verwendet. Dieses Verfahren wurde 1965 von Robert Letsinger entworfen und von Marvin Caruthers 1981 weiterentwickelt. Die Phosphoramidit-Methode umfasst zwei unterschiedliche Verfahren, das Phosphodiester- und das Phosphotriester-Verfahren.

Abb.1
Vom Monomer zum Polymer

Oligonucleotide werden mit DNA-Synthesizern automatisch hergestellt. Diese Geräte sind meistens in der Lage, neben Oligodeoxynucleotiden auch Oligoribonucleotide zu synthetisieren. Fast alle DNA/RNA-Synthesizer sind 2- oder 4-Säulen-Geräte, mit denen parallel zwei oder vier verschiedene Oligonucleotide hergestellt werden können.

Mit Hilfe der Synthesizer und hochentwickelter Reagenzien ist es heute möglich, Nucleinsäuren mit über 100 Nucleotiden Länge automatisch herzustellen. Die Zyklusdauer beträgt dabei ca. 3,5 Minuten. Da der Bedarf an synthetischen Oligonucleotiden durch molekularbiologische Methoden enorm angestiegen ist, werden Oligonucleotide heute üblicherweise als Auftragssynthesen kommerziell durchgeführt.

Auf den nächsten Seiten wird die chemische Synthese bzw. künstliche Herstellung von Oligonucleotiden behandelt. Die künstliche und gezielte Herstellung von bestimmten Oligonucleotid-Sequenzen ist für die Erstellung von spezifischen Primern, bei der DNA-Sequenzierung und bei der Mutagenese von enormer Bedeutung. Man unterscheidet dabei folgende Synthesearten :

  1. Phosphodiester-Verfahren
  2. Phosphotriester-Verfahren
  3. Phosphittriester-Verfahren

Halb- bzw. vollautomatische Phosphotriester- oder Phosphittriester-Festphasen-Systeme sind heute die üblicherweise verwendeten Syntheseverfahren. Die Entscheidung für eines der beiden Verfahren richtet sich nach Reaktivität und Stabilität der verwendeten Ausgangsstoffe, Reagenzien, Zwischen- und Endprodukte.

Ein weiteres Verfahren, das H-Phosphonat-Verfahren von Hall et al. (1957), wird heute nicht mehr angewendet, soll aber zunächst als Einstieg in das Thema dienen.

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