zum Directory-modus

Vorbereitung zum gentechnischen Praktikum

Transformation durch Elektroporation

Bei der Elektroporation wird die Zellmembran durch einen kurzen elektrischen Impuls so verändert, dass die Zellen DNA aus der Umgebung aufnehmen können. Diese Methode kann für sehr viele veschiedene Zelltypen eingesetzt werden. Vor der Elektroporation müssen die Zellen allerdings kompetent für die DNA-Aufnahme gemacht werden. Achtung: Die Herstellung elektrokompetenter E. coli-Zellen unterscheidet sich von der Herstellung CaCl2-kompetenter Zellen!

Die Herstellung elektrokompetenter Zellen

40 mL S.O.C.-Medium werden mit 2 mL einer Übernachtkultur angeimpft und bis zu einem Titer von 3 x 108 bei 37 °C geschüttelt. Der Ansatz wird dann für 15 min im Eiswasser abgekühlt und für 15 min im vorgekühlten Rotor der Kühlzentrifuge bei 6.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wird quantitativ entfernt und die Zellen in 5 mL bidest. Wasser resuspendiert. Der Zentrifugenbecher wird dann mit bidest. Wasser aufgefüllt und erneut für 15 min im vorgekühlten Rotor der Kühlzentrifuge bei 6.000 rpm und 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wird quantitativ entfernt, die Zellen in 20 mL 15 % Glycerol resuspendiert und erneut wie zuvor zentrifugiert und der Überstand entfernt.

Das Pellet wird nun in 0,5-1 mL 15 % Glycerol resuspendiert und in 100 µl-Portionen in Eppendorfgefäßen bei -80 °C eingefroren oder direkt zur Elektroporation eingesetzt.

Die Elektroporation

Die elektrokompetenten Zellen werden auf Eis aufgetaut, mit der Plasmid-DNA gemischt und für eine Minute auf Eis inkubiert, bevor der Ansatz dann in die vorgekühlten Elektroporationsküvetten (ebenfalls auf Eis) pipettiert wird.

Für die Elektroporation muss die Küvette gut abgetrocknet werden, bevor sie in die Pulsapparatur eingesetzt und der Elektropuls ausgelöst wird. Die Pulsdaten sind vom Elektrodenabstand abhängig und betragen für E. coli z.B. 25 µF, 600 Ohm, 2,5 kV.

Gleich nach dem Puls werden 1 mL S.O.C.-Medium zugegeben und der Ansatz in ein Eppendorfgefäß überführt. Nach einer Regenerationsphase von ca. 1 Stunde bei 28-30 °C können die transformierten Zellen auf Selektionsmedien ausplattiert werden.

S.O.C.-Medium

Seite 18 von 20