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Vorbereitung zum gentechnischen Praktikum

Die Gelelektrophorese: Einleitung

Die Gelelektrophorese ist ein biochemisches Trennverfahren, bei dem die Wanderung von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld zu deren Trennung ausgenutzt wird.

Abb.1
Gelelektrophorese-Apparatur

Nucleinsäuren sind Polyanione, d.h. sie sind aufgrund des Zucker-Phosphat-Rückgrats negativ geladen. Im elektrischen Feld wandern Polyanione zur Anode, und zwar umso schneller, desto kleiner sie sind. In der Gelelektrophorese wird üblicherweise Agarose, bei sehr kleinen Nucleinsäuren auch Polyacrylamid als Matrix eingesetzt. Die Porengröße der Matrix bestimmt, wie schnell eine Nucleinsäure mit einer bestimmten Größe zur Anode wandern kann. Bei längeren Fragmenten liegt eine stärkere Reibung als bei kürzeren Fragmenten vor, sie werden dadurch proportional stärker zurückgehalten und wandern daher langsamer. So wird in der Gelelektrophorese nicht nur eine Trennung der Moleküle erreicht, sondern auf der Basis der relativen Wanderungsstrecke kann auch die Länge eines DNA- oder RNA-Fragmentes im Vergleich zu einem Standard mit bekannter Fragmentgröße berechnet werden.

Anders als bei Proteinen ist bei Nucleinsäuren das Verhältnis zwischen Ladung und Größe (in Basenpaaren) konstant. Für lineare doppelsträngige DNA-Fragmente besteht im elektrischen Feld über einen weiten Größenbereich der DNA eine lineare Abhängigkeit zwischen dem dekadischen Logarithmus der Fragmentlänge (in Basenpaaren) und der relativen Wanderungsdistanz (in cm, bezogen auf die gesamte Wanderungsstrecke).

Abb.2
Agarose-Gelelektrophorese

In der Abbildung sind fünf Spuren zu sehen. Die linke Spur mit den vielen Banden repräsentiert den Marker. Die vier anderen Spuren mit ihren Banden sind DNA-Proben. Durch einen Vergleich der Lauflänge und Fragmentgröße von Markerbanden und Probenbanden kann die Fragmentgröße der (linearen!) Probenbanden ermittelt weden.

Die Trennung muss in einem salzarmen Milieu erfolgen, da nur so gewährleistet werden kann, dass die elektrische Feldstärke homogen auf die Nucleinsäuren einwirkt. Das Wanderungsverhalten nicht-linearer DNA kann nicht mit linearer Standard-DNA verglichen werden, da sich ringförmige DNA im Agarose-Gel völlig anders verhält.

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