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Praktikum 2: Restriktionskartierung

Restriktionsendonuclease-Typen

Man unterscheidet drei Typen von Restriktionsendonucleasen; für die Gentechnologie sind vor allem die Enzyme vom Typ II von Bedeutung.

Abb.1
Das Restriktionsenzym EcoRl

Typ I-Restriktionsendonucleasen

Diese Enzyme verfügen zugleich über Endonuclease- und DNA-Methylase-Aktivität. Es handelt sich um große Protein-Komplexe aus vielen Untereinheiten. Sie benötigen eine spezifische 15 Basenpaare lange Bindungsstelle auf der DNA, die sie entweder methylieren oder aber die DNA von dieser Position ausgehend in einer Entfernung von ungefähr 1.000 Basenpaaren vom 5'-Ende her unspezifisch schneiden. Besonders bemerkenswert ist die starke ATPase-Aktivität der Typ I-Restriktionsendonucleasen. Die Wanderung der Enzyme entlang der DNA ist sehr energieaufwändig, so dass bei jeder gespaltenen Phosphodiester-Bindung über 10.000 Moleküle ATP zu ADP und anorganischem Phosphat umgesetzt werden. Die Enzyme dieser Kategorie sind für die Gentechnologie weitgehend uninteressant, da nur die Bindungsstellen auf der DNA, nicht aber die Schnittstellen spezifisch sind.

Typ II-Restriktionsendonucleasen

Typ II-Restriktionsendonucleasen sind die bei Arbeiten mit rekombinanter DNA am häufigsten verwendeten Restriktionsendonucleasen, da die spezifischen Erkennungs- und Schnittstellen im Gegensatz zu den übrigen Restriktionsendonuclease-Typen identisch sind. Dies ermöglicht eine punktgenaue Isolierung von DNA-Fragmenten mit definierter Länge und definierten Enden. Mittlerweile sind mehr als 3.000 Enzyme dieses Typs aus verschiedenen Bakterienspezies bekannt, und etwa 1.000 davon auch kommerziell erhältlich. Typ II-Restriktionsendonucleasen sind unabhängig von ihren entsprechenden Modifikationsmethylasen und benötigen kein ATP. Die Erkennungssequenzen umfassen mit 4-8 Basenpaaren einen meist palindromen Sequenzbereich.

Typ III-Restriktionsendonucleasen

Die Typ III-Restriktionsendonucleasen haben, ebenso wie die Typ I-Restriktionsendonucleasen, sowohl Endonuclease- als auch Methylase-Aktivität. Auch dieser Enzym-Typ schneidet die DNA unspezifisch außerhalb der Erkennungssequenz, allerdings in einer Entfernung von nur ca. 5-20 Basenpaaren. Damit liegt der ATP-Verbrauch der Typ III-Restriktionsendonucleasen deutlich unter dem Verbrauch der Typ I-Enzyme, da bei der Wanderung von der Erkennungssequenz zur Position der Schnittstelle ein deutlich kürzerer DNA-Abschnitt passiert werden muss.

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